光 化 学 内 化 （photochemical internalization, P C I ) 可以通过光定向破坏细胞的内吞小泡的机制得到高效的转染（Berg et al.1999)。这项技术的原理是先将光敏剂定位于细胞内吞小泡的膜上，然后光照导致膜的破裂。内吞化合物（如核酸）就释放到细胞中作用于其靶点或进一步转运到细胞核中。作者：T.弗里德曼等,译者：殷勤伟等，本实验来自「基因转移」

操作方法

光化学增强基因转运

步骤

光化学增强基因转运 材料

试剂

准备转染的细胞

适当的细胞培养液

核酸或重组病毒

在使用之前用细胞培养液新鲜稀释核酸（如 DNA 多聚物），用无血清的细胞培养液或 PBS按照感染滴度新鲜稀释重组腺病毒、腺相关病毒或其他可能内吞的病毒。

DNA 或病毒载体的使用数量要根据细胞株和载体的具体情况定。我们推荐使用 D N A 浓度为 0. 2〜5ug/ml, 病毒的起始感染滴度为 5 个感染颗粒/细胞。

磷酸盐缓冲液（PBS)

光敏剂： AIPcSai或TPPS2a (Porphyrin 产 品 ， Logan， U tah )
光敏剂的储存溶液的配置：溶 解 5 m g 的 A I P c S 2 a 或 2 m g 的 T P P S 2 a 于 0. 2 ml 0 •l m o l / L 的NaOH 中， 用无菌 PBS 加至终体积为 i ml。过滤除菌，分装，储存于-20℃, 最 长 6 个月。使用光敏剂溶液时要注意避光。也要避免长时间的储存或反复冻融，否则会造成光敏剂聚合 ，导致效果下降。光敏剂溶液如果溶解不完全可以用超声仪处理几秒钟。

氢 氧 化 钠（N aO H ; 〇. l m 〇 l/L )

仪器

CO2 培养箱， 37°C

光源， 670nm (AIPcS2a) 或 420nm (TPPS2a): LumiSource (PCI Biotech, AS,Oslo, Norway)

细胞培养皿

方法

简单的实验计划，参见图 2B。

1.接种细胞于细胞培养皿中，使细胞贴壁。

培养皿的选择根据分析方法而定。例如，如果用流式细胞仪考察细胞的转基因表达效率，则可采用 12 孔板，每孔铺 75 000 个细胞。

2.准备工作浓度的光敏剂，在使用之前用细胞培养液稀释。用 5〜20ug/m l 的 AIPcS2a或 0 •2〜lug/ml 的 TPPS2a。

光敏剂浓度要根据光源、光强和光敏剂的吸收谱覆盖的波长范围定。要确保所有的步骤都在非激发光下操作以避免不可控的光敏剂激活，保护细胞不受光化学伤害。体外实验时可以关掉实验台的灯。

3.移除细胞培养液. 并加入含光敏剂的细胞培养液。在 37°C , CO2 培养箱中培养16〜18 h 。

4.移除含光敏剂的细胞培养液，用无光敏剂的细胞培养液洗 3 次。继 续 37°C 培 养 4 h。

在此期间，在指定的时间点加入核酸（如 DNA 多聚物）或重组病毒载体溶液。推荐的培养时间是：非病毒基因载体 3. 5 h，重组病毒载体 30 min。
如果用光化学内化转运药物，同时加人光敏剤和大分子药物然后孵育细胞（如在移除光敏剂之前培养 18 h)。然而，核酸转运时推荐先加光敏剂孵育然后加核酸。

5.移除载体并洗一遍细胞。 37°C ， CO2 培养箱中孵育 30 min。

6•将细胞曝光，采用的光剂量依据前言中的介绍来确定。

如果想降低细胞膜的损伤，在无光敏剂中培养细胞 1〜4 h 后再曝光。

7•将细胞放在黑暗环境中继续培养 24〜48 h 后分析转基因效率。

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