分级分离(Fractionation)由低速到高速离心逐渐沉降。先用低速使较大的颗粒沉淀，再用较高的转速，将浮在上清液中的颗粒沉淀下来，从而使各种细胞结构，如细胞核、线粒体等得以分离。

操作方法

基本方案

材料与仪器

小白鼠
蔗糖 氯化钙溶液 甲苯胺兰染液 詹纳斯绿B染液 NaCl溶液
玻璃匀浆器 离心机 天平 光学显微镜 载玻片 盖玻片 离心管 滴管 量筒 烧杯 玻璃漏斗 解剖剪 镊子

步骤

1.  用颈椎脱位的方法处死小白鼠后，迅速剖开腹部取出肝脏，剪成小块（去除结缔组织）尽快置于盛有0.9%NaCl的烧杯中，反复洗涤，尽量除去血污，用滤纸吸去表面的液体。   2.  将湿重约1 g 的肝组织放在小平皿中，用量筒量取8 ml 预冷的0.25 mol/L 蔗糖-0.003 mol/L 氯化钙溶液，先加少量该溶液于平皿中，尽量剪碎肝组织后，再全部加入。   3.  剪碎的肝组织倒入匀浆管中，使匀浆器下端浸入盛有冰块的器皿中，左手持之，右手将匀浆捣杆垂直插入管中，上下转动研磨3~5次，用3层纱布过滤匀浆液于离心管中，然后制备一张涂片①，做好标记，自然干燥。   4.  将装有滤液的离心管配平后，放入普通离心机，以2500 rpm，离心15分钟。

（1）缓缓取上清液，移入高速离心管中，保存于有冰块的烧杯中，待分离线粒体用。

（2）同时涂一张上清液片②做好标记，自然干燥。

（3）余下的沉淀物进行下一步骤。   5.  用6 ml 0.25 mol/L 蔗糖-0.003 mol/L 氯化钙溶液悬浮沉淀物，以2500 rpm 离心15分钟弃上清，将残留液体用吸管吹打成悬液，滴一滴于干净的载玻片上，涂片③，自然干燥。   6.  将①、②、③涂片用1%甲苯胺兰染色后盖片即可观察。

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