多药抗药基因的表达实验主要用于肿瘤治疗研究。

操作方法

PCR扩增法

原理

大多MDR细胞膜上出现MDR-1基因及其基因产物P-糖蛋白过度表达。 多药抗药基因的表达实验是通过反转录和PCR的方法来检测这些特定基因的过度表达。

材料与仪器

RNA
PBS 氯仿 异丙醇 萘酸 异硫氰酸肽 十二烷基肌酸钠 构橼酸钠 乙酸钠 二疏基乙醇 乙醇 Taq酶
离心机 紫外分光光度计 琼脂糖凝胶电泳 PCR仪

步骤

一、细胞总RNA提取

1.  收集约5x10⁷个细胞，冷PBS洗涤。

2.  加入400 ul RNA提取液（含6 mol/l 的异硫氰酸肽，0.5%十二烷基肌酸钠，0.025 mol/l 构橼酸钠pH7.0，0.25 mol/l 乙酸钠，pH4.0，0.5%二疏基乙醇，50%萘酸），混匀。

3.  加入400 ul 氯仿，混匀，以13 000 r/min 于4℃离心15 min。

4.  取上清液加入等体积的异丙醇，4℃放置30 min。

5.  然后以13 000 r/min 离心15 min，吸上清，将RNA成点用75%的乙醇洗涤1次，溶于100 ul 的无菌双蒸馏水中。

6.  并用紫外分光光度计检测RNA纯度（A₂₆₀/A₂₈₀应为1.8~2.0）后备用。

二、反转录及PCR扩增

1.  引物

注意事项

1. 尽可能在低温下操作；2. 适量斟酌Trizon等的用量；3. 在每一次离心后除尽蛋白质、不溶物提取操作时必须戴手套、口罩等防止DNA酶的影响；4. 注意Trizon带有腐蚀性；5. 最重要的就是防止DNase的污染，手套、口罩必不可少，所用的枪头和EP管等也要RNA提取专用的，无DNA酶的。

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