在液氮中研磨植物材料, 使部分细胞破碎, 进一步使植物细胞在裂解液中裂解, 用醋酸钠和氯仿沉淀蛋白质, 异丙醇沉淀核酸, 溶解后经氯化锂沉淀总RNA, 洗涤后得到高质量的RNA。本实验旨在了解和掌握植物总RNA 的分离和纯化方法。

操作方法

研磨法

原理

在液氮中研磨植物材料, 使部分细胞破碎, 进一步使植物细胞在裂解液中裂解, 用醋酸钠和氯仿沉淀蛋白质, 异丙醇沉淀核酸, 溶解后经氯化锂沉淀总RNA, 洗涤后得到高质量的RNA。本实验旨在了解和掌握植物总RNA 的分离和纯化方法。

材料与仪器

植物RNA
尿素 Tris-HCl Na2 EDTA NaCl Tris饱和酚 SDS LDS 醋酸钠 氯仿-异戊醇 异丙醇 TE 缓冲液 LiCl 乙醇
研钵 烧杯 离心机

步骤

取5～10 g 材料放入研钵中, 加入过量液氮, 迅速研磨成均匀的粉末(在研磨过程中, 保证材料始终浸在液氮中, 研磨约30 min) 。   待液氮自然挥发干净后, 将材料转入100 ml 的离心管中, 加入6 ～ 8 倍体积的裂解液1 , 轻轻搅拌后, 0 ℃ 冰浴20 min。12000 r/ min , 4 ℃离心15 min。   取上清, 加入1/ 3 体积的3 mol/ L 醋酸钠, 1/ 5 的氯仿异戊醇, 轻轻摇匀, 0 ℃冰浴20 min。   2000 r/ min , 4 ℃离心15  min ( 加5 倍体积裂解液2 溶解沉淀以提取DNA)。   取上清, 加入等体积冰浴冷却的异丙醇, 混匀且冰浴10 min。   5000 r/ min , 4 ℃ 离心10 min , 将沉淀溶于5 ml 含有0 . 1%SDS 的TE 缓冲液中, 加入8 mol/ L LiCl 使终浓度至2 . 5 mol/ L,冰浴3 h 或4 ℃过夜。   12000 r/ min , 4 ℃离心10 min。
  70%乙醇洗涤沉淀两次, 空气干燥10 min , 溶于无菌水(DEPC 焦碳酸二乙酯, 处理) , 加入1/ 10 体积10% 的SDS, 重复第4～6 步骤, 进一步除去蛋白质, 70%乙醇20 ℃长期保存。

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