本方案设计为 24 个 PCR 反应，使用 3 种 cDNA 亚群（利用方案 3 中的 H-T11M 引物进行 RT 反应），引物为荧光染料标记的锚定引物（FH-T11M) 与 24 种上游任意引物 (HAP) 的组合。本实验来源于 PCR 实验指南（第二版），作者：种康，瞿礼嘉。

操作方法

FDD-PCR实验

材料与仪器

cDNA 矿物油
热循环仪 薄壁 PCR 管

步骤

一、材料

1. 缓冲液、溶液和试剂

矿物油（可选）

2. 核酸和寡核苷酸

来自方案 3 的 cDNA

3. 专用设备

热循环仪 [推荐使用 GeneAmpPCRSystem9600(Perkin-Elmer)，或者 Mastercyder(EppendorfScientific)]

0.2 ml 薄壁 PCR 管

4. 附加试剂

RNAspectraFluorescentmRNA 差异显示系统（GenHunterF501~F510&R501-R510)，包括蒸馏水、10XPCR 缓冲液（100mmol/LTris-HCl、pH8.4，500 mmol/LKC1，15 mmol/LMgCl₂,0.01% 明胶）、FDDdNTP 混合液（2.5 mmol/L)、荧光锚定引物（FH-TUM)(2umol/L) 以及任意引物（H-AP)(2umol/L)

二、方法

1. 在不同的 1.5 ml 离心管中，为每个 FH-TUM 锚定引物单独配制一个 FDD-PCR 主体混合液。

蒸馏水                                                                 91.8ul

10XPCR 缓冲液                                                   18.0ul

FDDdNTP 混合液                                                 14.4ul

FH-T11M 引物（M=G、A 或 C)                            18.0ul

Taq DNA 聚合酶（Qiagen201207Valencia，CA) 1.8ul

2. 将热循环仪的程序设置为：94°C15s→40°C2 min→72°C60s→40 个循环→4°C 平衡。
如果使用的不是推荐的热循环仪，那么将变性（94°C)'时间调整为 30s。

3. 各取 16ul 相应的 FDD-PCR 主体混合液，加到标记好的 0.2 ml 薄壁 PCR 管中。例如，将 8 个管子标记为锚定引物 FH-T₁₁ G 与任意引物 H-AP1~8 的组合，同样标记好所有的 24 个引物组合，包括 FH-T11A 与 H-AP1~8 和 FH-T11C 与 H-AP1~8。

4. 在每个 0.2 mlPCR 管中，加入 2.0ul 相应的 cDNA(来自方案 3 的 RT 反应）。

5. 在每个 0.2 mlPCR 管中，加入 2.0ul 相应的 H-AP, 混匀，总反应体积为 20ul。如果需要，加入 25ul 矿物油。

6. 将 0.2 mlPCR 管放到热循环仪中，开始运行程序（见第 2 步）。完成后，反应产物在黑暗中-20°C 保存。

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