将自噬体和线粒体特异性蛋白的基因与荧光蛋白基因连接起来构成融合基因，导入细胞内表达，借助荧光显微镜或者共聚焦显微镜对标记蛋白进行细胞内活体跟踪，可对自噬体和线粒体进行共定位可视化分析。

应用

观察线粒体自噬的动态变化。

操作方法

自噬体与线粒体免疫荧光共定位

原理

将自噬体和线粒体特异性蛋白的基因与荧光蛋白基因连接起来构成融合基因，导入细胞内表达，借助荧光显微镜或者共聚焦显微镜对标记蛋白进行细胞内活体跟踪，可对自噬体和线粒体进行共定位可视化分析。

材料与仪器

细胞、12 孔板
自噬体特异性蛋白 EGFP-LC3
线粒体特异性蛋白 DsRed-mito
无血清培养基、PEI 转染试剂
荧光显微镜或者共聚焦显微镜

步骤

1、铺板：取对数生长期的细胞胰酶消化后铺 12 孔板，铺板量以次日转染时达到 70~80% 左右为宜。

2、转染：准备两个 1.5 mL EP 管，分别加入 50 μL 无血清培养基，一管加入适量的 EGFP-LC3 和 DsRed-mito 质粒，另外一管加入 3 倍体积的 PEI 转染试剂（DNA 质粒量: PEI = 1:3），室温静置 5 min 后，将两个 EP 管里面的液体混合，室温静置 15 min 后，将转染后复合物逐滴缓慢加入到细胞中，4~6 h 后更换为完全培养基。

3、观察荧光：转染 24 h 后即可在荧光显微镜或者共聚焦显微镜下观察荧光。在同一视野下，分别在蓝色激发光下观察自噬体绿色荧光 EGFP-LC3 以及在绿色激发光下观察线粒体红色荧光 DsRed-mito。如有需要可以采用 DAPI 染核，在紫外激发光下观察细胞核蓝色荧光。最后将 Images 进行 Merge，观察自噬体和线粒体的荧光共定位情况。

注意事项

1、血清对转染效率有很大影响，转染时细胞要采用完全培养基（不含抗生素），并用无血清培养基稀释质粒 DNA 和转染试剂。

2、细胞状态很关键，细胞复苏后的 3 代左右时细胞状态最好，尽量不要用传过多代的细胞。

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