检测支原体有两种不同的策略：第一种方法将在下述方案中述及，利用对 DNA 染色的荧光染料 Hoechst 33258, 它对细胞核周围（在细胞表面或胞质中）的特殊物质进行染色，可显示支原体污染；第二种方法是利用 DNA 探针识别细胞提取物中的 DNA 支原体特异序列，进行支原体污染的检测。本实验来源于细胞实验指南（上册)，作者：黄培堂。

操作方法

荧光显微镜检测支原体

原理

检测支原体有两种不同的策略：第一种方法将在下述方案中述及，利用对 DNA 染色的荧光染料 Hoechst 33258, 它对细胞核周围（在细胞表面或胞质中）的特殊物质进行染色，可显示支原体污染；第二种方法是利用 DNA 探针识别细胞提取物中的 DNA 支原体特异序列，进行支原体污染的检测。对这个方案，照试剂供应商（fisher Scientific) 的说明进行。

步骤

1) 准备下列液体，然后除菌并冷藏。

无酚红的 HBSS

NaCl                                   8 g
KCl                                     0.4 g
CaCl₂                                0.14 g
MgSO₄•7 H₂O                  0.1g
MgCl₂•6 H₂O                   0.1g
Na ₂   HPO₄•2  H₂O           0 .06 g
KH ₂ PO₄                            0.06 g
葡萄糖                              1.0 g
NaHCO₃                          0.35 g
dH₂O                               1000 ml

Hoechst 1000x 贮存液

柠檬酸/磷酸盐缓冲液（2X)

0.1mol/L 柠檬酸                         22.2 ml
0.2mol/LNa ₂  HPO₄                   2 7.8 ml
用柠檬酸或 Na ₂  HPO₄ 调节 pH 为  5.5。

2) 滴人 1~2 滴胰蛋白酶消化细胞于培养皿中的 Labtek 玻片上或盖玻片。

3) 加人 1~2 ml 培养液覆盖表面，让细胞生长 2~3 天。

4) 准备 Camoy 固定液（应在每次用前制备新鲜的)。

Camoy 固定液
3 份甲醇
1 份冰乙酸

5) 吸干培养液，不用洗涂单层细胞并直接加人 Camoy 固定液于 Labtek 室内或培养皿中。培养皿中充满 Camoy 固定液（约 5 ml）室温中放置平皿 2 分钟。

6) 去除培养皿中液体，加人新鲜固定液以充满室内或培养皿中（约 5 ml)。室温中放置平皿 5 分钟。

7) 重复歩骤 6。

8) 去除固定液，去除 Labtek 室的塑料外套或将培养皿的玻片拿出，让细胞在室温中晾干 30 分钟或更长。

9) 用 Hoechst1000x 储存液（步骤 1) 配制 Hoechst 工作液。

Hoechst 工作液

工作液宜每次新鲜配制

用 10ml HBSS 稀释 0.1 ml Hoechst 储存液（0.5ug/ml)

用 5 ml HESS 稀释 0.5 ml Hoechst 储存液（0.05ug/ml)

或

用 50 mlHBSS 稀释 50ul Hoechst1000x 储存液；每 Coplin 染缸中加人 40 ml。

10) 室温条件下，在 HBSS 配制的 Hoechst 工作液（终浓度为 0.05ug/ml) 中染色玻片 10 分钟。

11) 用 dH₂O 漂洗两次。

12) 等体积混和甘油、梓檬酸/磷酸缓冲液（在步骤 1 中制备），制备封闭培养液以覆盖住细胞。

13) 在玻片和盖玻片之间加入 2 滴封闭培养液，用纸巾轻轻吸出多余液体。

14) 用橡胶黏合剂封闭玻片和盖玻片。

15) 用荧光显微镜观察标本。应用激发波长为 330/380nm 和光栅过滤器 LP440nm。

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