本实验主要用于固定冰冻切片。

操作方法

冰冻切片固定实验

原理

原位杂交中所用冰冻切片必须用多聚甲醛固定，然后再脱水。

材料与仪器

冰冻组织
PFA PBS 乙醇
加湿盒

步骤

1.  将承有切片的载玻片放入加湿盒中，加4%PFA覆盖整个切片，盖上加湿盒，如为预先未固定过的组织，则于室温放置20 min，如是固定过的组织则放置5 min。

2.  吸去固定液，用毛细吸管或用喷水瓶以3xPBS冲冼切片，并温育5 min。

3.  用1xPBS重复步骤2操作，吸去PBS，按顺序以30%、60%、80%、95%和100%乙醇依次冲洗切片，每次2 min。

4.  晾干载玻片并保存在放有干燥剂的密封盒中，于-70℃存放可达数周。开盒前应将其平衡至室温。

图一、加湿盒

注意事项

1. 固定及时是冷冻切片制作的第一要 素 ,固定的最佳时机应在切片后马上将裱好组织切片的载玻片放进固定液中固定。固定液要保持新鲜，经常更换。

2. 甲醇固定时间快 ,细胞收缩小 ,对细胞核和抗原保存较好。缺点是挥发性强 ,毒性较大。

95%乙醇是兼有脱水作用的固定液 ,渗透力弱 ,固定速度慢 ,对糖原蛋白固定效果较好 ,能溶解脂类 ,易造成组织细胞收缩。丙酮能使蛋白沉淀 ,渗透力强 ,细胞收缩严重 ,对细胞核固定相对较强 ,对酶的固定较好 ,作用相当于乙醇 ,对糖原没有固定作用。AF液是乙醇和甲醛液混合的固定液 ,兼有乙醇和甲醛液的作用 ,固定的同时有脱水的作用。AAF液与 AF液固 定液作用相似 ,固定同时有脱水作用。因其中多了冰醋酸成分 ,故能迅速固定染色质 ,且固定效果均匀 ,还能抵消一部分乙醇对组织的收缩作用。

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