基因合成可应用于：

（1）代谢通路合成；（2）基因网络构建；

（3）疫苗设计。

操作方法

基因合成实验

原理

基因合成是指在体外人工合成双链DNA分子的技术，与寡核苷酸合成有所不同：寡核苷酸是单链的，所能合成的最长片段仅为100nt左右，而基因合成则为双链DNA分子合成，所能合成的长度范围50bp-12 kb。基因合成是用人工方法合成基因的技术，是基因获取的手段之一，相对于从已有生物中获取基因来说，基因合成无需模板，因而不受基因来源限制。

材料与仪器

DNA
dNTP DAN聚合酶 乙醇 TE 限制性内切核酸酶缓冲液
水浴锅 培养箱

步骤

1. 将两种寡核苷酸各1 μg加入微量离心管中，加水至17 μl，再加2 μl 的10×测序酶缓冲液。70℃加热5 min，然后在合适的退火温度下保温5 min，取2 μl 留待以后的分析。

2. 加2μl 4种dNTP混合液和10U测序酶，30℃温育30min。

3. 70℃ 10min 灭活DNA聚合酶，取2 μl 留待以后的分析。

4. 加10×限制性内切酶反应缓冲液，加水和20——100 U 的适合于克隆的限制性内切酶至100 μl。适当的温度下消化2 h以上。

5.  酚抽提，加100 μl 4 mol/l 乙酸铵和400 μl的无水乙醇，-70℃沉淀15 min，离心5 min，沉淀重悬于100 μl TE缓冲液，用乙醇再沉淀一次，用95%乙醇洗涤沉淀，干燥，20 μl TE缓冲液溶解，取2 μl用于以后的分析。

6. 用筛分型琼脂糖凝胶电泳分析确证原材料、延伸产物和酶切产物，估计延伸的寡核苷酸的量，再用适当的载体亚克隆。

7. 对几个合适的亚克隆测序。

注意事项

1. 反应液的配制、分装请一定使用新的（无污染）枪头、Microtube等，尽量避免污染。

2. 配制反应体系时，应注意移液器的使用方法，所有的液体都要缓慢加至管底，不要加至管壁，所有液体的混匀都要用振荡器进行，避免产生气泡。

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