用染料叠氮标记寡核苷酸
         1. 配制以下储备溶液：
         - 200 mM THPTA [三（3-羟基丙基三唑甲基）胺] 水溶液
         - 100 mM CuSO4 水溶液
         - 炔基改性寡糖水溶液（尽可能浓缩，例如 >10 mg/mL）
         - 100 毫摩尔抗坏血酸钠水
         - 10 mM 叠氮染料，溶于二甲基亚砜或水

         2. 在反应前将 CuSO4 与 THPTA 以 1:2 的比例混合并充分涡旋几分钟。此工作溶液冷冻后可稳定数周。
         3. 在炔烃改性寡聚物溶液中加入过量的叠氮染料（摩尔比为 2-5 个当量）。
         4. 加入 5 个当量的 THPTA/CuSO4 工作溶液（来自步骤 1） 
         5. 加入 10-30 当量的抗坏血酸钠。
         6. 在室温下搅拌、涡旋或摇动反应混合物 30-60 分钟。
         7. 乙醇沉淀或用所需的方法（如 HPLC）纯化寡聚物。

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用染料叠氮化物标记生物聚合物
         1. 配制以下储备溶液：
         - 200 mM THPTA 配体水溶液
         - 100 mM CuSO4 水溶液
         - 炔基改性生物聚合物水溶液（尽可能浓缩，例如 >5 mg/mL）。
         - 100 毫摩尔抗坏血酸钠溶于水 - 10 毫摩尔叠氮染料溶于二甲基亚砜或水。

         2. 在反应前几分钟，将 CuSO4 与 THPTA 配体按 1:2 的比例混合。该溶液冷冻后可稳定数周。
         3. 在炔烃改性的生物聚合物溶液中加入过量的叠氮染料（负载比率：5-20 个叠氮染料/炔烃）。
         4. 加入 5 摩尔当量（参考叠氮染料）的 THPTA/CuSO4。
         5. 加入 10 个摩尔当量的抗坏血酸钠（参照叠氮染料）。
         6. 在室温下搅拌、涡旋或摇动反应混合物 30-60 分钟。
         7. 通过凝胶过滤或透析纯化所需的分子。

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用染料叠氮或染料炔标记细胞、细胞裂解物或生物样本
         1. 制备以下点击溶液：
         - 100 mM THPTA 配体水溶液或水
         - 20 mM CuSO4 水溶液
         - 300 mM 抗坏血酸钠水
         - 2.5 mM 水或二甲基亚砜中的炔或叠氮标记试剂

         2. 将下列试剂加入 1.5 毫升微量离心管中，然后短暂涡旋混合。
         - 50 µL 细胞或细胞裂解物样品
         - 50 µL PBS 缓冲液
         - 50 µL 5 mM 叠氮染料（或染料炔）检测试剂DMSO 或水

         3. 加入 10 µL 100 mM THPTA 溶液，短暂涡旋混合。
         4. 加入 10 µL 20 mM CuSO4 溶液，短暂涡旋混匀。
         5. 加入 10 µL 300 mM 抗坏血酸钠溶液以启动点击反应，短暂涡旋混匀。
         6. 保护点击反应物避光，在室温下孵育 30 分钟。
         7. 细胞或细胞裂解物现在已被点击标记，可进行下游处理和/或分析。

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用染料叠氮化物标记多肽
         1. 制备以下储备溶液：
         - 200 mM THPTA 配体水溶液
         - 100 mM CuSO4 水溶液
         - 水或 DMF 中的炔基修饰肽（取决于肽的溶解度，尽可能大于 10 mg/mL）。
         - 100 mM 抗坏血酸钠（水溶液
         - 10 mM 叠氮染料，溶于 DMSO 或水

         2. 在反应前几分钟，将 CuSO4 与 THPTA 配体按 1:2 的比例混合。该溶液冷冻后可稳定数周。
         3. 在炔烃修饰的肽溶液中加入过量叠氮染料（摩尔比为 5-10 个当量）。
         4. 加入 5-10 等量的 THPTA/CuSO4。
         5. 加入 10-20 当量的抗坏血酸钠。
         6. 在室温下搅拌、涡旋或摇动反应混合物 30-60 分钟。
         7. 用 HPLC 纯化所需的多肽。

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用染料叠氮化物标记小型有机炔分子
         1. 配制以下储备溶液：
         - 200 mM THPTA 配体水溶液
         - 100 mM CuSO4 水溶液
         - 水或 DMF 中的炔化合物（取决于化合物的溶解度，尽可能大于 10 mg/mL）。
         - 100 毫摩尔抗坏血酸钠溶于水
         - 10 mM 叠氮染料，溶于 DMSO 或水（有关推荐溶剂，请参阅我们的网站）。
         2. 在反应前几分钟，将 CuSO4 与 THPTA 配体按 1:2 的比例混合。该溶液冷冻后可稳定数周。
         3. 在炔烃溶液中加入过量叠氮染料（摩尔比为 5-10 个当量）。

         4. 加入 25 当量的 THPTA/CuSO4。
         5. 加入 50 等量的抗坏血酸钠。
         6. 室温下搅拌反应混合物 30-60 分钟。
         7. 用色谱法或其他方法纯化所需的分子。

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附录 I. 染料寡核苷酸共轭物的 HPLC 纯化
乙醇沉淀

         一些商用寡核苷酸通常含有一些干扰化合物，特别是胺类物质，如三乙胺或 Tris，以及铵盐，因此我们强烈建议您在开始标记反应之前提取并沉淀商用寡核苷酸样品。另一方面，标记混合物中含有标记的寡核苷酸、未标记的寡核苷酸、水解染料酸和未结合的染料 SE。标记反应产生的水解染料酸和未结合染料 SE 等杂质可通过乙醇沉淀有效去除。为进一步纯化 0.1-1 毫克经 HPLC（3-30 A260 单位）纯化的商用寡核苷酸样品，对以下方案进行了优化。

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         1) 将目标寡核苷酸溶解在 100 μL 去离子水中，然后用等体积的氯仿提取三次。
         2) 加入十分之一体积（10 μL）的 3 M NaCl 和两个半体积（250 μL）的冷绝对乙醇沉淀寡核苷酸。混合均匀并在 -20°C 下放置 30 分钟。
         3) 在微型离心机中以 10,000 至 15,000 g 离心溶液 30 分钟。
         4) 小心去除上清液，用 70% 的冷乙醇冲洗颗粒 1-3 次，并在真空下干燥。
         5) 将干燥的颗粒溶于去离子水中，使最终浓度大于 50 μg/μL。这种胺修饰寡核苷酸储备溶液可立即使用或在≤-15℃下冷冻保存。

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HPLC 纯化 
         标记的寡核苷酸可使用分析或半制备型 HPLC 仪器，使用标准分析型 C8 或 C18 色谱柱，通过反相 HPLC 进行纯化。为进一步纯化 0.1-1 毫克标记的寡核苷酸（3-30 A260 单位），对以下方案进行了优化。
         1) 将乙醇沉淀后的颗粒溶解于 0.1 M 醋酸三乙胺（TEAA）中。

         2) 将溶解的颗粒装入 0.1 M TEAA 中的色谱柱，用 5-95%乙腈线性梯度进样 30 分钟。注 1：将会出现与未标记的寡核苷酸、标记的寡核苷酸和游离染料相对应的峰。

注 2：要确定峰的特性，应同时监测 260 纳米波长处和染料最大吸光度 (λmax) 处的吸光度。对于只有一个检测器的仪器，应运行两个小样品，每个样品在不同的波长下进行监测。未标记的寡核苷酸仅在 260 纳米波长处显示吸光度。游离染料和标记的寡核苷酸在 260 纳米波长（寡核苷酸的吸光度 A260）和染料的吸光度最大值（染料的吸光度 Amax）处都有吸光度；染料标记的寡核苷酸的 A260:Amax 比值高于染料或水解染料。

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凝胶电泳纯化
         1) 倒入 0.5 毫米厚的聚丙烯酰胺平板凝胶。
注：对于长度小于 25 个碱基的寡核苷酸，使用 19% 的丙烯酰胺；对于 25-40 个碱基的寡核苷酸，使用 15% 的丙烯酰胺；对于 40-100 个碱基的寡核苷酸，使用 12% 的丙烯酰胺。
         2) 将乙醇沉淀后的颗粒重悬于 200 μL 50%甲酰胺中，在 55°C 孵育 5 分钟以破坏二级结构。
         3) 将加热后的寡核苷酸装入凝胶，然后用 50%甲酰胺加 0.05%溴酚蓝装入相邻孔。注意：您可能需要使用多个孔。
         4) 运行凝胶，直到溴酚蓝指示剂染料到达凝胶三分之二处。

         5) 从玻璃板上取下凝胶，放在保鲜膜上。
         6) 将凝胶放在荧光 TLC 板上。
         7) 用手持式紫外光源照射，找出标记和未标记的寡核苷酸。

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