使用双蒸水和灭菌技术。

牛血清白蛋白（B S A ) 片段 V

CaCl2 (2.0m ol/L)

溶 解 29.4 g CaCl2 于 IOOml H2O 中。过滤除菌。 4-C 储 存 。

细胞

293 细胞许多不同 的 亚 克 隆（ Graham e ta l.1 9 7 7 ) 都 适 用 。选择一个已知的具有高转染效率的亚克隆。冻存多管以确保可重复性。转染前不要让细胞长过 。 一 个冻存管可以复苏并在生长培养基中维持生长 4〜6 周用于转染。这之后，再复苏一个新管。

氯 喹（100 mmol/L)

于 IOml 水 中 溶 解 0.52 g 磷酸氯喹。过 滤 ， 4°C 储 存 。

细 胞 因 子（Xf 靶细胞有特异性）

干细胞因子（SCF)

Flt3-配 体（FL)

血小板生成素（T P O )

DlO

DlO 即 DMEM 加 10% 热灭活的 FBS， 100 单位/m l 青霉素 G 和 IOOfigM l 链霉素。

二甲基亚砜（DMS 〇， 5% )

DM EM 培养基

胎 牛 血 清（F B S ) , 热 灭 活（56°C ， 30m i n )

造血细胞

可 以 用 已商业化的试剂和方法（MiltenyiBiotec, Auburn, California) , 采用磁珠将来自脊髓 、夕卜周血或脐带血的人类 CD34+细胞分离出来。鼠的造血细胞可以从骨髓和 Miltenyi 体系缺陷系中获得。用 5-氟 尿 嘧 啶（5FU) 对 鼠 进 行 预 处 理 有 利 于 干 细 胞 的 富 集。 此优化程序适用于非组织培养 6 孔板的造血再生细胞的转导。若用不同面积的平板或培养皿，则应相应的调整细胞密度和试剂体积。

2 X HEPES 盐

于 400 ml 水中溶解 8.18 g NaCl 和 5.96 g HEPES。用 0. 5mol/L NaOH 调整 pH 为 7.10, 用水 调 整 终 体 积 为 500 ml, 过 滤 。最 终 溶 液 为 280 mmol/L N aC l 和 50 mmol/L HEPES。 4°C储存。

人类纤连蛋白片段 C H -296 (RetroNectin， Takara S h u z o， O t s u ， Japan)

用无菌水溶解冻干的 RetroNectin 至 lmg/m l 浓度。 0.22 叫 1 滤膜过滤 。 一 20°C 保存。

磷酸缓冲液（P B S )，无钙镁离子

磷酸混合液
将 4.95 ml 1.0mol/L N a H 2P04 (于 IOOml 水溶解 12 g 单价盐）， 10.05 ml l. 〇 mol/LNa2 H P 04 (100m l 水中溶解 26.8 g 二代磷酸盐）和 85m l 水混合。过滤， 4-C 储存。

质 粒 D N A

Aφ质 粒 载 体（含有目的基因）

辅助质粒： P C i G S A ^ 、 p C i P S 、 p C i E S

质 粒 D N A 可 以 用 QIAGEN 试 剂 盒 或 CsCl 梯度离心纯化，用苯酚和氯仿萃取，乙醇沉淀后T E 中 重 悬（pH 8.0)。质 粒 可 以 在 68°C 下 热 处 理 30m in 以消灭细菌防止污染。四个质粒F V 载体生成体系的细节详见图 1。

丁 酸 钠（500m m o l /L )

溶解 5. 5 g 丁酸钠于 100 ml D M E M 中。过滤，一 20°C 储存。

转导培养基

浓缩的载体在含 2 〇 % FB S 的 D M EM 中，并且此 DM EM 含下列细胞因子（对靶细胞有特异性）： 干细胞因子（SCF)、 Flt3-配 体（FL)、 血小板生成素（TPO)，浓度各为 l 〇〇 ng/ml。

TE: I X (配方如下）和 0.1 X 溶液

10 mmol/L Tris-HCl (pH 8. 0)

lmmol/L EDTA

仪器
离 心 管（2 个 250m l 或几个 50m l 管）

离 心 机（B e c k m a n S W 28 转头和管）

Millipore 滤 器（0.45fzm 和 0.22fxm; 0.45p m Stericup/Steritop 滤 器 ， DuraporeP V D F , S C H V U 02R E )

平 板（6 孔板）

SlideA-Lyzer 试 剂 盒（10K m .w . cutoff; PierceBiotechnology, 66450)

组织培养皿（I O c m )

37℃水浴

方法

F V 载体的生成
1.转染前 24 h， 用 IOml D l O 于组织培养皿 （I O c m ) 接 种 3. 25X10⁶ 个 293 细胞，共 23盘 ，过夜培养。

2.用磷酸钙-D N A 沉淀转染细胞。

a. 将下列组合准备 9. 2m l D N A 溶液：
1 .15 ml 2. 0mol/L CaCl2

初的收集结合。显微镜下观察确保所有的细胞都被收集。
被转导的细胞可在液体培养基中生长，用于干细胞克隆反应或动物移植实验。

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