姬姆萨染色是一种以天青类染料与伊红为核心的复合染色方法，常用于血液与骨髓涂片的细胞形态学观察，以及疟原虫、立克次体等病原体的显微识别。该方法通过酸性与碱性染料对细胞不同化学组分的选择性结合，获得细胞核与胞浆的高对比度着色。染色效果对缓冲体系pH、固定方式、染色时间及冲洗条件高度敏感，因此需在受控工艺窗口内操作并配合质量控制。

一、目的与适用范围

        本Protocol适用于外周血涂片、骨髓涂片及相关细胞涂抹标本的姬姆萨染色，用于细胞形态学观察与初步分类计数，并可用于疟原虫等血液寄生虫的显微筛查。针对染色体制片的带型显示，可在标准染色前增加蛋白酶类温和消化步骤，以获得更清晰的带型对比。

二、作用机理

2.1 染料组成与选择性结合

        姬姆萨染液通常由天青色素（天青类/美蓝衍生物）、次甲蓝及伊红等组成，属于复合型罗曼诺夫斯基染色体系。酸性染料伊红倾向与碱性蛋白质结合，使嗜酸性结构呈粉红至红色；碱性染料（美蓝/天青类）倾向与核酸及酸性蛋白结合，使细胞核及嗜碱性结构呈蓝紫至紫红色；中性颗粒在等电状态下可同时与两类染料结合，呈淡紫色。

2.2 pH对染色结果的影响

（1）基本规律

        细胞内多种成分以蛋白质形式存在，蛋白质作为两性电解质，其带电状态随溶液pH变化而改变，从而影响与酸性或碱性染料的结合倾向。偏酸环境更易强化伊红结合，整体染色偏红；偏碱环境更易强化天青/美蓝结合，整体染色偏蓝。

（2）工程控制要点

        为获得可重复的染色对比度，稀释或配制染液建议使用规定pH的缓冲液；冲洗用水应接近中性；载玻片需清洁且避免酸碱残留污染；固定用甲醇应质量稳定且含水量可控。

三、材料与试剂

3.1 主要试剂

（1）姬姆萨染色液

        可采用两液法（A液与B液）或标准姬姆萨储备液按要求稀释使用。染液应避光保存，使用前如出现沉淀应按规定过滤或静置取上清。

（2）甲醇固定液

        用于涂片固定，建议使用分析纯或以上等级甲醇，避免水分与杂质导致细胞变形或背景着色异常。

（3）缓冲液与冲洗水

        稀释染液与终止反应建议使用规定pH的磷酸盐缓冲液（常用范围约pH6.8，具体以试剂说明书为准）。冲洗用水应接近中性，避免酸碱偏离造成染色漂移。

（4）蛋白酶处理液（可选）

        用于染色体带型显示或特殊标本预处理，可选用胰蛋白酶/蛋白酶等进行温和消化。处理强度需通过预实验确定，以避免过消化导致结构破坏。

3.2 耗材

        清洁载玻片、一次性滴管或移液器吸头、染色架/染色缸、吸水纸、镜油等。

四、仪器设备

        光学显微镜（建议配备100×油镜）、计时器、吹洗耳球或微风装置（用于两液混匀形成涟漪状液面）、通风设施（甲醇使用）、37℃温箱或恒温干燥设备（寒冷或高湿环境可选）。

五、样本与涂片制备

5.1 外周血涂片

（1）制片

        采用推片法制备薄而均匀的血涂片，自然干燥。涂片厚薄会影响染色时间与细胞形态判读，应尽量保持一致性。

（2）固定

        根据实验室规范以甲醇固定（常见为1–3分钟），固定后自然挥干。具体固定时间可随试剂体系与室温适当调整。

5.2 骨髓涂片

（1）制片要点

        骨髓标本纤维蛋白含量较高，凝固较快，取材与推片需迅速完成以减少凝块与细胞破坏。

（2）抗凝选择提示

        不建议使用草酸盐抗凝的骨髓标本进行形态学染色，以免出现细胞核变形、核染色质致密或胞质空泡等伪影并影响判读。

六、操作步骤

6.1 染色前准备

（1）载玻片清洁与标识

        载玻片应洁净、干燥、无油污与酸碱残留；标本编号与信息应在染色前完成标识，避免染后污染或混淆。

（2）缓冲体系与环境条件

        按规定配制缓冲液并校核pH；室温、湿度对蒸发与染色动力学有影响，必要时在恒温条件下进行以提高批间一致性。

6.2 预处理与固定（可选/按标本类型）

（1）蛋白酶处理（染色体带型显示）

        对需要获得带型对比的染色体制片，可在染色前使用蛋白酶进行短时间、温和消化处理，随后以缓冲液终止并轻柔冲洗。消化时间与浓度需通过预实验确定，以获得清晰横纹而避免过度消化。

（2）甲醇固定（血液/骨髓涂片）

        将完全干燥的涂片置于染色架上，以甲醇固定后挥干。固定不足可能导致细胞洗脱，固定过度可能增加背景或影响染色对比，应按实验室既定窗口执行。

6.3 两液法姬姆萨染色流程

（1）A液预染

        在涂片表面滴加姬姆萨A液约0.5–0.8 mL，使染液覆盖整个标本区域，计时染色1分钟。

（2）加入B液并混匀染色

        在A液上滴加姬姆萨B液，滴加体积为A液的2–3倍。使用洗耳球轻吹形成微风，使液面呈涟漪状以促进两液充分混合。继续染色3–10分钟；其中血液涂片通常在加入B液后染色1–3分钟即可，骨髓涂片建议不少于5分钟。

（3）冲洗

        冲洗时不可先倾倒染液，应直接以缓慢流水自一端冲去染液，避免沉渣在涂片表面沉积造成背景颗粒。冲洗至流出液基本无明显颜色。

（4）干燥

        将载玻片竖置沥干后自然风干。寒冷或湿度较大时，可置于37℃温箱中保温促干，以减少细胞变形、皱缩或局部水痕。

6.4 显微镜检查

        先在低倍镜下选择涂片适宜区域（细胞分布均匀、形态保存良好），再用高倍镜及油镜观察细胞核、胞浆与颗粒着色特征，并按检验目的进行计数或病原体筛查。

七、结果特征与判读要点

7.1 典型着色表现

        姬姆萨染色后，细胞核通常呈紫红色或蓝紫色，胞浆多呈粉红色或淡蓝粉色背景；嗜酸性颗粒偏粉红，嗜碱性结构偏蓝紫，中性颗粒多呈淡紫。不同细胞系的核质比、染色质粗细与颗粒分布可在该对比体系下较清晰呈现。

7.2 染色体带型（适用时）

        在适当蛋白酶处理与姬姆萨染色条件下，染色体可出现深浅不同的横纹样着色。带型对比度取决于消化强度、染液浓度、染色时间与冲洗方式，应以标准带型清晰、背景干净为目标优化窗口。

八、质量控制与注意事项

8.1 关键控制点

（1）pH与水质

        染色对氢离子浓度敏感。缓冲液pH偏差、冲洗水偏酸或偏碱均可导致整体偏红或偏蓝，甚至造成细胞识别困难。建议批次染色前校核缓冲液pH并使用接近中性的冲洗水。

（2）涂片厚薄与染色时间

        染色时间需结合标本类型、涂片厚薄、有核细胞比例与室温进行微调。血涂片通常较薄、染色时间较短；骨髓涂片细胞密度高且基质复杂，染色时间通常更长。

（3）避免染液干燥与沉渣沉积

        染液量需充足，操作过程中避免局部蒸发干燥造成染料沉着。冲洗时不先倒掉染液可降低沉渣回落到涂片表面的风险；必要时按规范过滤染液以减少背景颗粒。

8.2 常见异常与调整方向

（1）整体偏蓝

        可由缓冲液偏碱、染色时间过长、染液过浓或冲洗不足引起。可优先检查pH并缩短染色时间或加强冲洗。

（2）整体偏红

        可由缓冲液偏酸、染色时间不足或固定/冲洗条件不当引起。可优先检查pH并适当延长染色时间或优化固定窗口。

（3）背景颗粒多

        常见于染液沉淀、染液干燥或冲洗方式不当。可考虑过滤染液、避免蒸发干燥，并按规定以流水直接冲去染液。

九、安全与废弃物处理

        甲醇具有挥发性与毒性，应在良好通风条件下操作并远离火源。生物样本与染色废液按所在单位生物安全与化学品管理规范分类收集与处置，避免直接排入下水系统。

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