这一程序改自最先由 Daryl Stafford 及其同事描述的方法（Blin and Stanfford 1976)。 当需要大量哺乳动物 DNA，如用于 Somhern 杂交或者用噬菌体 λ 载体构建基因组文库时，应选用这一方法。从 5X107 培养的非整倍体细胞 ( 如 HeLa 细胞）中可获得大约 200 μg，长度为 100~150 kb 的哺乳动物DNA。本实验来源「分子克隆实验指南第三版」黄培堂等译。

操作方法

用蛋白酶K和苯酚从哺乳动物细胞中分离高分子质量DNA

原理

这一程序改自最先由 Daryl Stafford 及其同事描述的方法（Blin and Stanfford 1976)。 当需要大量哺乳动物 DNA，如用于 Somhern 杂交或者用噬菌体 λ 载体构建基因组文库时，应选用这一方法。从 5X107培养的非整倍体细胞 ( 如 HeLa 细胞）中可获得大约 200 μg，长度为 100~150 kb 的哺乳动物DNA。

材料与仪器

蛋白酶 K 噬菌体 λ DNA 哺乳动物细胞、新鲜组织或者血样
醋酸铵 透析缓冲液 乙醇 裂解缓冲液 苯酚 TE Tris-缓冲盐溶液
脉冲电场凝胶或传统的水平 0.6% 琼脂糖凝胶 Sorvall 离心机及 H1000B、SS-34 转头 尖头切断的黄色尖头 透析管夹 振荡平台或透析管 Shepherd 氏钩 分光光度计或荧光计 旋转器 真空抽干仪 水浴 宽口移液管

步骤

一、材料

1. 缓冲液和溶液

醋酸铵（10 mol/L) (替代透析的一种选择，步聚 9)

透析缓冲液（替代乙醇沉淀的一种选择，步骤 9)（50 mmol/L Tris-Cl ( pH 8.0)，10 mmol/L EDTA (pH 8.0)，准备 4 份 4 L 透析液并于 4℃ 保存）

乙醇（替代透析的一种选择，步骤 9)

裂解缓冲液（10 mmol/L Tris-Cl (pH 8.0)，0.1 mol/L EDTA( pH 8.0），0.5% (m/V) SDS，20 μg/mg 无 DNase 的胰 RNase）

苯酚，用 0.5 mol/L Tris-Cl ( pH 8.0) 平衡

TE ( pH 8.0)

Tris-缓冲盐溶液（TBS)

2. 酶和缓冲液

蛋白酶 K ( 20 mg/ml)

3. 凝胶

脉冲电场凝胶或传统的水平 0.6% 琼脂糖凝胶

4. 核酸和寡核苷酸

完整的噬菌体 λ DNA

5. 离心机和转头

Sorvall 离心机及 H1000B、SS-34 转头（或其他相当的设备）

6. 专用设备

尖头切断的黄色尖头

透析管夹

振荡平台或透析管

Shepherd 氏钩（替代透析的一种选择）

分光光度计或荧光计

旋转器

真空抽干仪

50℃ 水浴

宽口移液管（开口处直径 0.3 cm)

7. 细胞和组织

单层或悬浮培养的哺乳动物细胞、新鲜组织或者血样

二、方法

以下是 4 种裂解不同类型细胞和组织样品不同版本的步骤 1。根据研究材料选用合适的方法裂解后步骤 2 。

1. 单层培养细胞的裂解

最好一次做 10~12 个培养皿，其余的保存在孵箱中，用前取出。

(1) 长满单层细胞的一批培养皿从孵箱中取出，迅速吸去培养液，并用冰冷的 TBS 洗 2 次。小心加入 10 ml TBS, 轻轻旋转数秒，将溶液倒入 2 L 烧杯中。加入 10 ml 冰冷的 TBS 并置于冰上。重复此过程将整批细胞做完。

(2) TBS 溶液倒入 2 L 烧杯，并吸去剩余的溶液。加入 1 ml 新鲜的冰冷 TBS, 并将培养皿置于冰上。重复此过程将整批细胞做完。

(3) 用一橡胶刮棒将细胞刮入 1 ml TBS 中。用巴斯德移液管将细胞悬液转移到冰上的离心管中。用 0.5 ml 冰冷的 TBS 冲洗培养皿，并入离心管中的细胞悬液。重复此过程将整批细胞做完。

(4) 于 1500 g ( 约 2700 r/min ) 离心 10 min 以收集细胞。

(5) 将细胞重悬于 5~10 倍体积的冰冷 TBS 中并再度离心。

(6) 用 TE ( pH 8.0 ) 重悬细胞至浓度为 5X10⁷ 个/ml, 转移至一个三角锥瓶中。

(7) 每毫升细胞悬液加 10 ml 裂解缓冲液，并于 37℃ 孵育 1 h, 立即进行步骤 2。

2. 悬浮培养细胞的裂解

(1) 将细胞转移至离心管并于 4℃ 1500 g ( Sorvall H100B 转头，2700 r/min ) 离心 10 min 以收集细胞。吸去上清。

(2) 用 1 倍体积冰冷的 TBS 重悬细胞并再度离心。吸去上清，小心地再次重悬细胞于冰冷的 TBS 中，离心收集细胞。

(3) 去上清，小心用 TE ( pH 8.0) 重悬细胞至 5X10⁷ 个/ml, 转移上清至三角锥瓶。

(4) 每毫升细胞悬液加 10 ml 裂解缓冲液，并于 37℃ 温育 1 h, 立即进行步骤 2。

3. 组织样品的裂解

由于组织通常含有大量纤维物质，很难从中获得高产量的基因组 DNA。在裂解之前将组织粉碎极大地提高抽提效率。大量的新鲜组织（>1 g）可用 Waring 搅拌器粉碎。

组织样品的研磨

(1) 将 1 g 新鲜切取的组织样品置于盛有液氮 Waring 搅切器的不锈钢杯中，以最高速度将组织粉碎。

(2) 液氮挥发，将组织粉末一点一点地加入盛有 10 倍体积（m/V) 裂解液的烧杯中，使其分散于裂解液表面，而后振摇烧杯使粉末浸没。

(3) 其完全分散于溶液中，将悬液转移至 50 ml 离心管，并于37℃ 温育 1 h, 立即进行步骤 2。

4. 新鲜抽取或冻存血细胞的裂解

(1) 从新鲜抽取或冻存样品中收集血细胞（人类血液需由熟练的采血师在无菌环境下抽取）

从新鲜血样中收集血细胞

① 收集 20 ml 新鲜血液于含有 3.5 ml 柠檬酸葡萄糖溶液 B (ACD) 或者 EDTA 的小管中。

② 血样转移至离心管并于 4℃ 1300 g ( Sorvall H100B 转头，2500 r/min) 离心 15 min。

③ 吸去上清。用巴斯德移液管将淡黄色层小心转移至新管中并再次离心。弃去红细胞沉淀。

淡黄色层为密度不均一的白细胞宽带。

④ 将淡黄色层重悬于 15 ml 裂解缓冲液中，并于 37℃ 温育 1 h, 然后进行步骤 2 。

从冻存血样中收集血细胞

① 收集 20 ml 新鲜血液于含有 3.5 ml 柠檬酸葡萄糖溶液 B (ACD) 或者 EDTA 的小管中。

血样可于 0℃ 保存数天并于 -70℃ 无限期保存。

② 室温水浴中解冻血样并转移至离心管，加入等体积磷酸盐缓冲液。

③ 于室温 3500 g ( Sorvall SS-34 转头，5400 r/min) 离心 15 min。

④ 吸去含有裂解红细胞的上清。将沉淀重悬于 15 ml 裂解缓冲液。并于 37℃ 温育 1 h, 然后进行步骤 2。

用蛋白酶 K 和苯酚处理细胞裂解液

2. 将裂解液转移至一个或者多个适合 Sorvall SS-34 转头的离心管中，裂解液不能超过 1/3 体积。

3. 加入蛋白酶 K ( 20 mg/ml) 至终浓度 100 μg/ml。用一玻棒温和地将酶混入黏滞的细胞裂解液中。

4. 将细胞裂解液置于 50℃ 水浴中 3 h, 不时旋转黏滞的溶液。

5. 将溶液冷却至室温，加入等体积的用 0.1 moI/L Tris-Cl (pH 8.0) 平衡过的苯酚。将离心管置于旋转器上，使离心管缓慢颠转 10 min 以温和地混合两相。如此时两相未能形成乳浊液，则将离心管置于旋转器上 1 h。

6. 室温 5000 g ( Sorvall SS-34 转头，6500 r/min ) 离心 15 min 以分离两相。

7. 用宽口移液管（出口直径 0.3 cm）将黏滞的水相转移至另一离心管。

8. 用苯酚再抽提两次，收集水相。

9. 用以下 2 种方法之一分离 DNA。

(1) 分离大小为 150~200 kb 的DNA

① 将水相转移至透析袋，透析袋顶部用透析管夹封口，袋中留有使样品体积增加 1.5~2 倍体积的空间。

② 于 4℃ 在 4 L 透析缓冲液中透析，其间换 3 次缓冲液，每次间隔 6 h。

由于 DNA 黏性很高，透析通常要超过 24 h 才能完成。

(2) 分离平均大小为 100~150 kb 的DNA

① 第三次用酚抽提后，将水相转移至另一离心管中 0.2 倍体积 10 mol/L 醋酸铵及 2 倍体积乙醇，旋转离心管直至溶液彻底混匀为止。

② DNA 随即形成沉淀。用 Shepherd 氏钩（末端封口并拉制成 U 型的巴斯德移液管) 将 DNA 沉淀从乙醇溶液中移出，污染的寡核苷酸仍留在其中。

③ 如果 DNA 沉淀成为碎片，不用 Shepherd 氏钩而在室温 5000 g 离心 5 min 收集沉淀。

④ 用 70% 乙醇洗涤 DNA 沉淀 2 次，按步骤 ③ 离心收集 DNA。

⑤ 尽可能用真空泵吸去残余的乙醇。于室温将 DNA 沉淀置于敞开的管内，直至可见的痕量乙醇挥发殆尽。

不要使 DNA 沉淀完全干燥，否则 DNA 将极难溶解。

⑥ 按每 0.1 ml 细胞（步骤 1) 加入 1 ml TE。将其置于摇床平台上，于 4℃ 温和振摇 12~24 h 直至 DNA 完全溶解。将 DNA 溶液储于 4℃。

10. 测定 DNA 的浓度。

11. 用脉冲凝胶电泳或者常规的 0.6% 琼脂糖凝胶电泳分析制备的高分子质量 DNA 的质量。用 λDNA 单体或者线性多联体作为分子质量标记物。

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