人肿瘤抗原可以：

（1）用于肿瘤诊断；（2）免疫治疗。

操作方法

免疫沉淀法

原理

本实验用Dynabeads protein A 进行免疫复合物的纯化。Dynabeads A 蛋白 （Dynabeads Protein A） 在免疫沉淀中有以下作用：

（1）将方案时间减少到 30 分钟。（2）显著降低非特异性结合造成的背景（3）保持蛋白质复合物的完整。对珍贵的蛋白质没有物理压力。

材料与仪器

肿瘤细胞
PBS 生理盐水 裂解液 蛋白酶抑制剂
培养瓶 细胞刮棒 离心管 低温离心机 -80℃冰箱 探针型超声波 恒温水浴锅

步骤

一、 裂解细胞

1.  方向刮取细胞。将细胞悬液转移到离心管，离心取沉淀，-80℃ 保存。（收集细胞要迅速，低温下进行，以减弱蛋白酶的作用）

2.  裂解细胞。采用RIPA 裂解体系，使用前40℃ 预冷，按10⁷ 个细胞加入1.0 ml 裂解液，吹打混匀，加入适量的蛋白酶抑制剂

（如cocktail）， 冰上放置3~5 分钟。

3.  超声处理裂解液。使用探针型超声进行多次适当频率的短促冲击，10~20秒/次，重复3 次，中间间隔10~20 秒，冰浴下进行。

4.  15 000 rpm，40℃离心15 min，吸取上清液于另一EP管中，置冰上。上清液用于下一步的预处理。  二、裂解物的预处理

使用正常人的血清对裂解物进行预处理。

1.  按1 ml 裂解物加2 ul 对照血清的比例加入正常人血清。

2.  室温孵育2~3 小时，缓慢摇动。
三、免疫复合物的纯化

1.  用Dynabeads protein A 进行免疫复合物的纯化。   2.  将Dynabeads protein A 振荡混匀，吸取100 ul 磁珠于EP 管中，置于磁铁架（Dynal MPC）上，磁珠吸附到管壁上，弃上清。   3.  加500 ul 0.1 M Na-phosphate (pH8.1 )至Ep 管，轻柔搓动管子约2~3 min，将EP管置于磁铁架上，磁珠吸附到管壁上，弃上清。   4.  重复2 步骤两次。   5.  清洗完磁珠后，加500 ul 预处理后的裂解物，反复摇动管子，室温下反应10~20 min。   6.  将EP管置于磁铁架上，磁珠吸附到管壁上，将上清转移至另一EP管中。   7.  用RIPA 裂解液清洗磁珠3 次。   8.  洗脱抗原-抗体复合物。加0.1 M citrate (pH3.1) 30 ul于Ep 管中，轻柔搓动管子约2~3 min，将P管置于磁铁架上，吸取上清于一EP管。   9.  重复步骤7，将上清收集于同一个EP管洗脱样品总体积为60 ul，作对照用。   10.  磁珠用0.1 M Na-phosphate (pH8.1 ) 清洗三次后备用。   11.  在步骤5 留取的上清中加入病人血清（1 ml 加2 ul 血清），缓慢摇动，室温孵育2~3 h。   12.  将EP管置于磁铁架上，磁珠吸附到管壁上，弃上清。   13.  重复步骤6~8。共收集到两份样品，对照与病人的纯化免疫复合物各60 ul。   14.  磁珠用0.1 M Na-phosphate (pH8.1 ) 清洗三次后加入柱储液100 ul，40℃ 保存。   15.  在样品中加入2xSDS 上样缓冲液并用1 M NaOH 调节pH 至使溴酚蓝呈蓝色。  四、结果分析

1.  1D SDS-PAGE用免疫沉淀后的样品可直接进行一维凝胶电泳，或者对磁珠上的蛋白A 或蛋白G 进行耦联剂修饰，洗脱后的样品可进行Western Blot。

2.  RIPA裂解液： 150 mmol/L NaCl；1.0%NP-40；0.5%脱氧胆酸钠； 0.1%SDS ；50 mmol/L Tris（ pH8.0）。

注意事项

为了避免抗体的共洗脱，在继续进行免疫沉淀之前，应该将抗体交联到免疫磁珠,建议使用交联剂。

常见问题

Dynabeads protein A 捕获的 Ig 量取决于起始样品中 Ig 的浓度。 100 µl Dynabeads A 蛋白可从含有 20- 200 µg IgG ⁄ml 的样品中分离约 25- 30 µg 人 IgG。 绝大部分位点与 Fc 结合，实现最优的 Ig 取向。

如需了解更多产品详情，请前往阿拉丁官网查询。

https://www.aladdin-e.com