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实验方案（Protocols）

IL-2 和 IL-4 的检测实验

· · 发布于 · 更新于 ·
简介

介绍 了 使 用 鼠 IL-2和 IL- 4 的中和抗体，在一种细胞因子存在的情况下来检测并定量其中一种细胞因子的方法。由于小鼠细胞不能针对人IL- 4产生应答，使用细胞株对建立人IL- 2 的特异性测定方法非常有用。可供选择的方法还有采用人IL- 4 受 体 cD N A转 染 的 CT.4S 细胞测定人 IL- 4 , 如 CT.h4S 细胞。这 些 细 胞 对 IOpgAnl的 人 IL- 4 有 应 答 ，也 对 高 浓 度 （>lOOU/ml) 的 人 IL- 2 有应答。作者：J.E.科利根等,译者：曹雪涛等，本实验来自「精编免疫学实验指南」

操作方法

IL-2和IL-4的检测实验

步骤

基 本 方 案 采 用 CTLL- 2 细 胞 检 测 小 鼠 IL - 2 和 IL -4 材 料

小鼠上清样品 重组小鼠 IL-2 (Amgen) 和 IL-4 (Genzyme) V R P M I -1 0 完全培养基 C T L L -2 T 细 胞 （A T C C ) 淋巴细胞 分 离 液 （LSM ; Organon Teknika Cappel) 3H TdR IL-2 封 闭 抗 体 （大鼠抗小鼠IL-2, S4B6; ATCC) IL-4封 闭 抗 体 （大鼠抗小鼠IL-4, 11B 11; A T C C ) 平 底 9 6 孔 板 （Costar) Srovall RT6000B 离心机及 50m l离心管 1•在9 6 孔板中，加 入 50/xl经 R P M I -I O 完全培养基稀释的样品上清及重组小鼠IL-2和 IL-4标 准 品 （一般进行5 倍稀释，从 1 0 % 〜0.016%)。每个样品做3 个复孔。 再次检测应使用同一批标准品来控制标准品每天的变化。 2 . 收集指数生长期的C T L L -2细 胞 （见 辅 助 方 案 2)，放 入 50m l 离心管中，加 入 R P - M I -1 0 完全培养基至总体积为50m l 。室 温 ， 335g 离 心 8min。倒去上清，用少量体 积的培养基重悬细胞（约 lml)，再 补 加 R P M I -10培养基至总体积50m l 。重复洗涤2 次 。 3 . 用台盼蓝拒染法测定细胞活性（附 录 3 0 。如果细胞活力小于9 0 % ，用 L S M 离心细 胞来 富 集 活 细 胞 （单 元 2.1)。 4 . 用 R P M I -I O 完全培养基重悬细胞，并调整细胞密度为IXlO5个细胞/m l 。 5 . 在 9 6 孔板的每孔加入50M1 细胞悬液。用塑料盖盖住孔板以防止蒸发。放 入 37°C ， 5 % C O 2培养箱中培养24h 。 6 . 加入3H T d R 继 续 培 养 24h (详 细 标 记 见 附 录 3E )。收获细胞，并 用 p 液闪仪测定 3H T d R 掺入值。 7 . 计算 总 T C G F 量 （见辅助方案1)。取半数最大刺激时的T C G F 浓度为l U /m l 。更精 确 计 算 5 0 % 活性的方法是将所得数据概率转换为直线图（GilUs M d . ， 1978)。 8 . 按照步骤1 所述准备4 块 新 的 定 量 孔 板 （起始及终浓度相同）。 9 . 按照步骤2〜4 所 述 用 R P M I -I O 完全培养基洗涤并重悬C T L L -2细胞。将细胞分成4 份 放 入 4 个离心管。 10. 在 C T L L -2细胞中加入封闭抗体 。 一 个离心管中加入抗IL-2, 一个加入抗IL-4， 一 个同时加入这两种抗体，另一管不加任何抗体。 含 有 抗 IL-2 抗体的管测定IL- 4 特异性，反之亦然。含有两种抗体的管测定不 确定的淋巴因子诱导CTLL- 2 的增殖，这样可以检测所有的IL- 2 和 IL- 4 引起的生 物学活性，排除其他的诱导因素。 根据抗体活性确定所要加入抗体的浓度（封闭抗体浓度不变），通 过 100〜1000 倍改变相关纯化的或重组淋巴因子的农度来控制滴度曲线（图 5. 1. 1)。
图 5. 1 . 1 在 有 /无 抗 IL-4 ( I l B l l ) 和 抗 IL-2 (S 4 B 6 )的 情 况 下 C TLL 细 胞 对 含 有 IL-4和 IL -2 的 上 清 的 增 殖 反 应 。 上 清 以 5 倍 增 量 的 稀 释 度 稀 释 （从 1 : 1 0 稀 释 度 开 始 ）， 分 别 加 人 至 5 X IO3个 C T L L 细 胞 （见 基 本 方 案 ）。 48h 后 检 测 3H T dR 掺 人 值 ， 以 总 cpm 值 表 示 。 1 1 . 在 9 6 孔板的每个孔中加入步骤8 中准备好的 50^1 CTLL- 2 细 胞 悬 液 （一块板应对 应一个离心管中的细胞），重复步骤5〜7。 1 2 . 通过比较总T C G F 单位数和封闭抗体存在下的T C G F 单位数来分别计算单独的IL- 2 和 IL- 4所诱导的TCGF。 例如，确 定 IL- 2 存 在 时 T C G F 的单位数比例是通过比
较 总 T C G F 和 抗 IL-4 存在时的 T C G F 单位数获得。通过比较抗 IL-4 抗体存在下的
T C G F 活性和两种抗体都存在下的 T C G F 活性的不同来计算 IL-2 活性。
IL-2 活性单位也可用已建立的小鼠 IL-2 标准计算得到。

备 选 方 案 1 采 用 CTLL-2 细 胞 检 测 人 IL -2 附 加 材 料

人血清或上清样品 重组人 IL-2 (A m g e n ) V P B S ， H B S S ，或其他盐溶液 1 . 用 R M P I -10完全培养基稀释IL-2 标准品和样品。在 9 6 孔 板 中 加 入 IOOfXl标准品及 样品， 3 个复孔。培养基作为阴性对照，也作为样品中所存在的任何刺激因素（有丝 分裂原、抗原、佛波醇酯）的对照。 滴 定 IL-2标准品取能够使细胞达到最大D N A 合 成 的 最 低 稀 释 度 （通 常 20〜 40U /mlI L -2)。典型标准曲线的范围为20U /m l 到 低 于 0.3U /m l 。使用一致的标准 品稀释度减少各次C T L L -2反应间的变化。 培养上清稀释率用1 : 1、 1 : 2、 1 •• 4。如果最大刺激在1 : 4 时，则进行进一步 稀释。人血清样品可能需要进一步稀释，因为通常人血清含有IL-2抑制剂，会影响 测定结果。为了控制抑制剂的活性，用含有人血清和不含有人血清的R P M I -10稀释 重 组 IL-2标准品。 2 . 在最后一次换液后2d 收 集 C T L L -2细胞。用 P B S 洗 涤 细 胞 3 次 ：细胞转到50m l 离 心管中，加入5〇 1111?88。 4。 (：， 335尽离心1〇 111丨11。弃 上 清 ，用 小 量 体 积 （约11111) 的 P B S 轻轻地重悬细胞沉淀，然后补足到50m l 体积。离 心 ，重 复 2 次 。用 2〜5ml R P M I -10完全培养基重悬细胞沉淀。 3 . 计数并用R P M I -10完全培养基调整细胞密度为5 X 104个细胞/m l 。在 9 6 孔板每个孔 中加入IOOiUl细胞悬液。 4 . 放 入 37°C ， 5 % C O 2培养箱中培养28h 。如果培养箱中的湿度不够的话，孔板用塑料 盖盖住以防止液体蒸发。 5 . 在最 后 8h 加入3H T d R (附录3E )。收获细胞并用P 液闪仪测定3H T d R 掺 入 值 （附 录 3E )。 如果细胞经过相同时间的刺激并经过相同时间后收获，则这种检测方法具有较 高的重复性。

备 选 方 案 2 采 用 CT.4S 细 胞 检 测 小 鼠 IL -4

一 般 C T L L -2 细 胞 对 IL-2 有较好的应答，但 是 对 IL-4 的应答则时有变化。 C T L L -2 的变异亚系 C T .4S 细 胞 对 IL-4 有较强的应答，对 IL-2 的应答次之，对其他已知的细胞因 子 则 不 应 答（H u -L i ^ W . ， 1989); 因此，使 用 C T .4S 可以高灵敏度地特异性检测 IL-4。 C T .4S 能用来从含有 lOOU/m l 的 IL-2 或其他细胞因子的样品中特异性地定量小 鼠 IL-4。无需使用单克隆抗体来中和 IL- 4 , 但 在确定由 IL- 4 引起的活性时则需要用到 。 C T .4S 细胞对人 IL-4 不应答。 C T .4S 细胞从 D n W .E . Paul 获 得（Laboratoryof
Immunology， National Insitute of Allergy and Infectious Diseases， Bethesda， M D20892)。 C T .4S 细胞的培养见辅助方案 3。

备 选 方 案 3 采 用 CT.h4S 细 胞 检 测 人 IL -4 附 加 材 料

重组人 IL-4 (R & D Systems) C T .h4S 细 胞 （Dr. W .E . Paul， Laboratory of Immunology， National Insitute of Allergy and Infectious Diseases, Bethesda? M D 20892) V P B S 细胞刮 1. 稀 释 IL-4标 准 品 和 样 品 （见基本方案，步 骤 I)。 2 . 在最后一次换液后2d 收 集 C T .h4S 细胞，用细胞刮从培养瓶上刮下细胞。放 入 50ml 离心管，计 数 （附 录 3 0 。加 入 50ml P B S 洗 涤 1 次 ， 4°C ， 220g 离 心 lOmin。用 R P M I -I O 完全培养基重悬细胞并调整细胞密度为5X 104个细胞/m l ，置于冰上。 离心细胞时不要超过265尽，在没 有 IL- 4 时不要超过30min。 3 . 加 IOOm I细胞悬液到含有IL-4标准品、样 品 及 培 养 基 （阴性对照）的各个孔中。放 入 37°C ， 5 % 0 ) 2培养箱中培养4811。 4 . 加人3H T d R 并 继 续 培 养 18h 。收 获 细 胞 并 用 P 液闪仪测定3H T d R 掺 入 值 （附录 3E )。

辅 助 方 案 1 白细胞介素或 T 细 胞 生 长 因 子（TCGF) 单位的计算

用 C T L L -2检测到的数据可以很好地通过概率分析进行处理，概率分析参照由国际 癌症研究所的生物应答调节计划（B R M P ) 提 供 的 标 准 IL-2制备物或者内部标准IL-2 制备物进行分析。在下面的例子中，使 用 B R M P 标准作为对照。 1 . 将样品3H T d R 掺 入 值 c p m 转换成最大c p m 的百分数。 2 . 将转换好的数据画成概率图（稀释率对最大计数百分数；图 5. 1 . 2 ) 或直接转换成对 数值。 3 . 将 X 轴转化成对照生长因子样品稀释率的Iog2形式。未稀释样品为0, X 轴上的稀释 率依次标记为1〜5。 4. ^ 轴 表 示 5 0 % 生 长 因 子 （F 5 q) 活性单位，为 样 品 的 F 5。/对 照 的 F 5。。 B R M P 对照在
图 5. I, 2 CTLL 细 胞 对 人 IL- 2 和 IL- 2 参 照 试 剂 BRMP的 增 殖 应 答 。 ^ 轴 上 的 5 0 % 活 性 时 在 : 9 处取得。因此， B R M P 对 照 稀 释 率 的 Iog2 为2 ^ 9或 3. 73, 3.73/3. 73 = 1U 活性。 rIL-2的 F 5 q的 ^ 值 为 3 ，同样的表示成指数形式为23 或 8。因此， rIL-2样品含有8/3.73或2.1411活性。 图 5. 1. 2 中比较了 B R M P 标 准 品 和 rIL- 2 样 品 （Cetus)。从图上可以得到 B R M P 标 准 品 和 rIL-2 样 品 最 大 D N A 合成的一半分别为7. 9U /m l 和 4U /ml。最大 D N A 合成一半时得到的不同数值，强调了在比较用多种检测方法检测样品时同一来 源的对照IL- 2 的重要性，也可能是每个试验室之间的差异导致的。

辅 助 方 案 2 小 鼠 CTLL- 2 细胞的维持 附 加 材 料

重组人 IL-2 (A m g e n )
75c m 2 组 织 培 养 瓶（Corning)
1 . 用 添 加 l U /m l 重 组 人 IL- 2 的 R P M I -I O 完全培养基维持连续增殖的 C T L L -2 细胞。
其 他 来 源 的 IL- 2 也 可 以 维 持 C T L L - 2 生 长 ，但 C T L L - 2 细 胞 的 增 殖 除 了 因 为 IL-2以 外 还 可 能 依 赖 于 其 他 来 源 的 生 长 因 子 ，这 在 生 物 检 测 中 会 产 生 较 高 的 背 景 应 答 。 2 . 以 0. 5 XIO5〜IXIO 6个细胞/m l 的接种密度将C T L L -2细 胞 用 25ml R P M I -I O 完全培 养基加到 75cm2培养瓶中培养。 3 . 收获细胞时用力吹打培养瓶使贴壁C T L L -2细胞脱落。 4 . 当密度达到IX IO 6个细胞/ m l 时 以 1 : 5 或 I : 1 0 传 代 （通常每周传代2 次）。 5 . 传代后至少2d 再使用细胞。 传 代 后 C T L L -2 细 胞 的 IL-2 受 体 会 立 即 饱 和 ，若 在 此 时 使 用 细 胞 会 导 致 高 背 景 且 降 低 灵 敏 度 。

辅 助 方 案 3 小 鼠 CT.4S 细胞的维持 附 加 材 料

75cm2组 织 培 养 瓶 （Corning) 1 . 用 添 加 lOOU/m l 重组 鼠 IL-4的 R P M I -10完全培养基维持连续增殖的C T .4S 细胞。 其他来源的1乙-4，如 用 （：〇 11八 刺 激 的 010.&4.11^2丁 细 胞 克 隆 （八丁(：0 的 上清，也可以维持C T .4S 细胞的生长，并且更加经济。 2 . 以 0 •5 X 105〜I X l O 6个细胞/m l 的接种密度将C T .4S 细 胞 用 15ml R P M I -I O 完全培 养基加到75cm2培养瓶中培养。 3 . 收获细胞时用力吹打培养瓶使贴壁C T .4S 细胞脱落。 C T .4S 细胞为贴壁细胞，在指数期收集细胞密度可达I X l O 6个细胞/m l 。 4 . 当密度达到I X l O 6个细胞/m l 时 以 1 : 5 或 I : 1 0 传 代 （通 常 每 周 传 代 2 次）。所有 洗涤及重悬细胞的操作要快速进行，因为细胞会重新贴壁。 5 . 传代后至少2d 再使用细胞。 和 C T L L -2 细胞一样，传 代后C T ,4S 细胞的IL- 2 受体会饱和

辅 助 方 案 4 小 鼠 CT.h4S 细胞的维持

C T .h4S 细胞的维持在C T .4S 细胞培养液的基础上，添加终浓度为lmmol/L 丙酮 酸 钠 （G I B C O /B R L ) 和 10ng/m l 重组人IL-4 (R & DSystem)。丙酮酸钠用于维持转染 细胞的活性。细胞通常每周传代2 次 ，每 隔 4 天 若 没 有 新 鲜 的 IL- 4 细胞将不能存活。 含 有 IL-4的新鲜培养基应每周配制一次。这种细胞的长期培养不应添加人IL- 2 , 因为 细胞会转而对培养上清中的IL-2依赖 ，而丧失对人IL- 4 的依赖性。冻存细胞时需要加 重 组 IL-4。

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目录： 实验方案（Protocols）
探索主题： 免疫学实验

Da — 若无特别说明，分子量单位默认为道尔顿。   Mw — 重均分子量。   Mn — 数均分子量。

产品仅供科研与开发使用，不用于人体、动物、诊断或治疗。

引用本文

阿拉丁科学.《IL-2 和 IL-4 的检测实验》. 阿拉丁知识库，更新于 2024年12月23日。 https://www.aladdin-e.com/zh_cn/faqs/il-2-and-il-4-assays.html
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