定位检测抗原表达

原理

应用

检测各种抗原物质

操作方法

免疫细胞化学ICC

材料与仪器

【材料】样品，
【试剂，试剂盒】冷甲醇、丙酮，冷 PBS，Hoechst 或 DAPI（DNA 染色剂）， BSA ，Triton X-100

步骤

1.   固定1)   冷甲醇、丙酮固定样品 1-10 分钟，或含 3-4% 多聚甲醛 pH 7.4 的 PBS 室温固定 15 分钟。2)   冷 PBS 冲洗样品 2 次。2.   通透1)   将样品在含 0.25% Triton X-100 (或 100 μM 洋地黄皂苷或 0.5% 皂角苷)的 PBS 中孵育 10 分钟。Triton X-100 是最常用的去污剂，能增强抗体的穿透力。因为它对细胞膜有损坏作用，因此不适用于与细胞膜结合的抗原。2)   PBS 冲洗细胞 3 X 5 分钟。3.   封闭及孵育1)   细胞在含 1% BSA 的 PBST 中孵育 30 分钟，以阻断抗体的非特异性结合（封闭液也可以选择含 1% 明胶或 10% 与二抗同种动物来源的血清）。2)   细胞与抗体（含 1% BSA 的 PBST 稀释）在湿盒中共同孵育，室温 1 小时，或 4 °C 过夜。3)   弃去液体，PBS 冲洗细胞 3 X 5 分钟。4)   细胞与二抗在 1% BSA 中孵育，室温 1 小时，避光。5)   弃去二抗溶液，PBS 冲洗细胞 3 X 5 分钟，避光。4.   复染1)   0.1-1 μg/ml Hoechst 或 DAPI（DNA 染色剂）孵育细胞 1 分钟。2)   PBS 冲洗。5.   封固1)   向盖玻片上滴加一滴封固液封固。2)   用指甲油密封盖玻片防止变干并移至显微镜下观察。3)   -20 °C 或 4 °C 避光保存。

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