间接免疫荧光显微镜检术可使两种或更多种抗原可以在同一切片，同一时间内被显示出来，可用于（1）细胞标记；（2）免疫荧光筛选干细胞。

操作方法

基本方案

原理

通过使用激发波长及发射波长均不相间的荧光染料而进行的。通常限用两种荧光染料，最常见的是罗丹明（绿光激发，发射红光）和荧光素（蓝光激发、发绿光）联合使用。

材料与仪器

组织样品
第一抗体 IgG
玻片 加湿盒

步骤

1.  当进行双标记实验时，最重要的准则是：第一抗体应为不同类型，从而使第二抗体能分别识别之。第一抗体最好是来源于不同免疫动物。但如使用单克隆抗体，这一要求就有可能达不到，当使用单抗时，不同型的抗体如IgG和IgM，可被第二抗体确切区分。但不同亚类（IgG 1和IgG 2）的抗体通常不能被二抗确切区分。

2.  实验操作过程和“组织切片的免疫荧光标记实验”相同，例外的是所加第一抗体和第二抗体由两种第一抗体及两种第二抗体的混合成分所替换。   3.  在试图进行双标记实验之前，应进行单标记实验，摸出不同的第一抗体和第二抗体的最佳稀释度。

注意事项

1.  当进行双标记实验时，最重要的准则是：第一抗体应为不同类型，从而使第二抗体能分别识别之。第一抗体最好是来源于不同免疫动物。但如使用单克隆抗体，这一要求就有可能达不到，当使用单抗时，不同型的抗体如IgG和IgM，可被第二抗体确切区分。但不同亚类（IgG 1和IgG 2）的抗体通常不能被二抗确切区分。

2.  在试图进行双标记实验之前，应进行单标记实验，摸出不同的第一抗体和第二抗体的最佳稀释度。

3. 在进行双重染色之前，必须对所选择的一抗分别进行单独染色预实验，预实验条件必须与双染条件相同，在观察预实验结果和抗体定位正确后，再进行双染实验。

常见问题

组织切片做免疫荧光时，背景色重时的两种情况：

一、组织切片因染色过程或组织非特异荧光而出现的背景色；

二、拍照时因硬件设施或取景器设置而出现的背景色。

针对第一种问题有以下几点建议：1. 采用高品质的多聚甲醛固定减少普通甲醛的自发萤光 2. 切片厚度减薄 3. 切片贴片后流水冲洗干净减少杂质荧光 4. 一抗以及二抗漂洗干净（非常重要） 5. 选用高品质封片介质。

针对第二种问题有以下几点建议：1. 曝光时间的控制 2. 暗室操作。

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