免疫荧光标记技术（immunofluorescence technique）是将已知的抗体或抗原分子标记上荧光素，当与其相对应的抗原或抗体起反应时，在形成的复合物上就带有一定量的荧光素，在荧光显微镜下就可以看见发出荧光的抗原抗体结合部位，检测出抗原或抗体。

操作方法

悬浮细胞的免疫荧光标记实验

原理

免疫荧光标记技术（immunofluorescence technique）是将已知的抗体或抗原分子标记上荧光素，当与其相对应的抗原或抗体起反应时，在形成的复合物上就带有一定量的荧光素，在荧光显微镜下就可以看见发出荧光的抗原抗体结合部位，检测出抗原或抗体。

材料与仪器

悬浮细胞
多聚-L-赖氨酸
离心机 培养箱

步骤

1.  细胞在冰浴中冷却，然后用台式离心机于4℃以800 g 离心5 min，吸去培养液并以4℃PBS重悬细胞。   2.  离心吸去PBS，以1~2 ml 2%PFA固定液，或2%PFA固定液/0.1% Triton X-100重悬细胞，置冰上固定30 min。

3.  离心、吸去固定液，用15 ml 4℃ PBS重悬细胞，放5 min 后，用PBS再次洗涤细胞。

4.  稀释的第一抗体于4℃用微量离心机以13 500 g 离心2 min，250 μl 抗体足够用于5x10⁶细胞。   5.  离心细胞，吸去PBS，重悬细胞于第一抗体中，置4℃温育1 h。

6.  用4℃ PBS稀释细胞和抗体至15 ml。   7.  离心，吸去PBS，以4℃ PBS重悬细胞，重复1次。   8.  第二抗体4℃用微量离心机以13 500 g 离心2 min，5x10⁶细胞用250 ul 抗体足够。

9.  吸去PBS，以第二抗体重悬细胞，4℃温育1 h，重复步骤6及步骤7。

10.  除非立即观察细胞，否则在进行细胞浓缩的下一步操作之前应以铝萡包裹离心管并冷藏。   11.  离心细胞并以少量PBS重悬（勿用水），将细胞悬液滴于多聚-L-赖氨酸覆层的载玻片上，加上盖玻片，尽可能马上观察结果。

注意事项

1、荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，可能会使荧光提前衰退。

2、每次试验均需设置以下三种对照：

（1） 阳性对照：阳性血清+荧光标记物；

（2） 阴性对照：阴性血清+荧光标记物；

（3） 荧光标记物对照：PBS+荧光标记物。

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