免疫荧光标记技术（immunofluorescence technique）是将已知的抗体或抗原分子标记上荧光素，可用于（1）检查抗原抗体结合部位（2）免疫学和组织学检测。

操作方法

免疫荧光标记

原理

免疫荧光标记技术（immunofluorescence technique）是将已知的抗体或抗原分子标记上荧光素，当与其相对应的抗原或抗体起反应时，在形成的复合物上就带有一定量的荧光素，在荧光显微镜下就可以看见发出荧光的抗原抗体结合部位，检测出抗原或抗体。

材料与仪器

组织样品
PBS 抗体
玻片 加湿盒

步骤

1.  将湿纸巾铺于载玻片盒底部做成加湿盒，由冰冻切片仪中取出载有切片的载玻片，放入玻片盒中（每边放6片），或故湿盒中（载玻片勿相互接触）。   2.  待载玻片达室湿且未干时，铺加PBS于切片上（勿溢出玻片）。   3.  稀释的第一杭体于4℃用微量离心机以13 500 g 离心2 min（每一载玻片上加40~50 ul 抗体，应能盖住切片）。   4.  用与泵相连的巴斯德吸管，在切片的一端吸去玻片上的PBS，并从另一端加上抗体，盖上加湿盒，室温温育1 h。

5.  以PBS冼玻片3次（5 min/次），从切片一端加入新的PBS缓冲液，由另一端吸去旧的缓冲液。   6.  稀释的第二抗体于4℃用微量离心机以13 500 g 离心2 min（每载玻片可加40~50 ul 抗体）。   7.  将第二抗体加于切片上，置加湿盒中室温温育1 h，以PBS洗玻片3次（5 min/次）。

图一、免疫组化标记的各种方法

8.  将盖玻片放于纸巾上，滴加1滴Gelvatol 于盖玻片中央。翻过载玻片放于盖玻片上（勿施压），将玻片置工作台上，用铝箔覆盖避光放置30 min，使Gelvatol 凝结。

9.  显微镜下观察结果，或置玻片盒中贮于4℃。

注意事项

1、荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，可能会使荧光提前衰退。

2、每次试验均需设置以下三种对照：

（1） 阳性对照：阳性血清+荧光标记物；

（2） 阴性对照：阴性血清+荧光标记物；

（3） 荧光标记物对照：PBS+荧光标记物。

常见问题

免疫荧光技术中标本制作的基本程序近似于酶免疫组化，不同点如下：

1、免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其相同。

2、免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育，孵育时间根据抗体的工作浓度确定。

3、二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察。

4、免疫荧光在封片时常使用专用封片剂或甘油：0.01M PBS （1：1）。条件许可，建议购买抗淬灭的封片液，使标本可以保存更久。

5、荧光抗体的孵育以及后续处理需要避光。

6、荧光抗体染色假阳性可能会多，需要分别设定阳性和阴性对照。

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