石蜡样品的免疫组化染色方案（IHC-P）
石蜡样品的免疫组化染色方案（IHC-P）
注意：这个方案提供常规的实验流程，实际操作可能需要针对您的实验条件进行优化。
第一阶段 样品制备：固定
包埋前固定组织的方法有两种：
-组织已切除时的浸入式固定；
-通过血管系统进行原位固定灌注。
通常通过将小组织片浸入固定液中来获得充分的固定。尽管如此，灌注可以实现更快速、更均匀的固定，从而使组织保持逼真的状态。
（1）沉浸式
所需材料
-样品
-PBS缓冲液（例如，T494526）
-固定剂（例如：10%中性缓冲福尔马林（NBF），F301880）
步骤
1.使用干净的工具从源头切下一块组织，在PBS中清洗，并将样品放置于冰上。
2.用您选择的固定剂孵育样品来固定样品。
-将组织块浸入下列溶液之一中，4℃下浸泡18-24小时。
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表 1. IHC中的常见固定剂
*请注意，10% NBF和4% PFA（例如，P395744）中的甲醛浓度几乎相同。
注意：10%中性缓冲福尔马林（NBF）是最常用的。
当我们的数据表将IHC-P声明为经过测试的应用时，除非另有说明，否则已使用NBF固定剂。
请注意，丙酮和甲醇也会使样品透化。
固定时间可能需要优化：固定不足可能导致边缘染色，切片边缘有强信号，而中间没有信号。过度固定会掩盖表位；抗原修复可以帮助克服这种掩盖。
3.用PBS清洗组织3次。
（2）灌注
灌注涉及解剖麻醉动物并通过心脏将4%多聚甲醛（PFA）冲洗至其循环系统。在此过程之后，提取感兴趣的组织，并可以通过浸没进行进一步固定。
第二阶段 样品制备：包埋
固定后，样品即可包埋在石蜡中。该过程可以使用真空炉加热石蜡或使用自动包埋系统来进行。
所需材料
-样品
-PBS缓冲液（例如，T494526）
-乙醇（例如，E111991）
-二甲苯或其他清除剂（例如，X112051）
-石蜡（例如，P100933）
-组织包埋模具和包埋盒
-真空烘箱或自动包埋系统
步骤
1.用 PBS冲洗组织，直至固定剂完全去除。
2.室温下用乙醇脱水组织，然后用二甲苯清洗。
-在室温下，在Coplin罐中手动或在自动包埋系统中进行以下交换。
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注意：一些较大的组织块可以受益于较慢的脱水，即较长的孵育时间。
组织处理盒对于容纳样品非常有用，可以嵌入蜡块的背面，用作切片的锚定点。
您可以使用几种危险性较低的市售二甲苯替代品。请参阅制造商的说明，了解特定于该试剂的乙醇更换和安装程序。
3 .将组织在热石蜡中交换3次。
3.1检查石蜡制造商的说明书中推荐的温度——通常为50-60℃ 。
3.2在真空烘箱或自动包埋系统中进行交换。
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温馨提示：各个厂家供应石蜡。请小心使用适合您所用蜡的烤箱温度，如果不确定，请咨询制造商。
4 .将组织模具嵌入新鲜石蜡中。
4.1小心地将组织放入模具中，并在模具中填充石蜡。
4.2根据需要确定组织的方向，并使用包埋盒将组织锚定到模具上。
4.3将组织块放入冰箱约10分钟以使石蜡硬化。
第三阶段 样品制备：切片
一旦组织被嵌入，我们就可以将其切成切片并将其安装到显微镜载玻片上。
所需材料
-样品
-水浴
-加冰的容器
-玻璃显微镜载玻片
-切片机和刀片
-烤箱或载玻片干燥架
步骤
1.将石蜡包埋的组织块放在冰上冷冻。
提示：冷蜡可以通过支撑组织样本内较硬的元素来获得更薄的切片。
融化的冰渗透到组织团块中的少量水分将使组织更容易切割。
2 .在水浴中加入超纯水并加热至40-45℃ 。
3 .设置切片机和刀片。
3.1将刀片放入支架中。
3.2遵循切片机制造商的说明来指导设置间隙角度。
图 1. 刀片间隙角。设置正确的间隙角度可以避免刀面与块体表面之间的接触。
提示：应调整刀片间隙角以达到最佳性能。
4 .将石蜡块插入切片机并固定方向。
注意：在切割石蜡块之前，可以小心地切割一些薄的部分，以确保定位正确。必要时进行调整。
5 .修剪团块以暴露组织表面。
5.1修整厚度通常为10 - 30 µm。
5.2这有助于后面可以剪切更具代表性的部分。
6 .将切片切成3 - 10 µm的厚度。
-部分会像丝带一样脱落。
提示：您可能需要丢弃前几个部分，因为它们可能包含因修剪而造成的孔。
7 .在水浴上分离切片并将其放在显微镜载玻片上。
7.1拿起切片带，将其浮在水浴的表面上，使其变平。
7.2用镊子将切片分开。
7.3将切片从水浴中挑到显微镜载玻片上，并将它们放在载玻片架上。
8.在烤箱中干燥切片。
-将载玻片架放入烤箱中，63 - 65℃ 30 - 60分钟或37℃过夜。
提示：37℃过夜干燥切片，不易损伤热敏抗原。
第四阶段 脱蜡
样品需要进行脱蜡以去除蜡并使抗体能够渗透。抗原修复步骤也将有助于进一步暴露抗原，并且通常是固定在福尔马林中的组织所必需的。
在进行抗体孵育之前，我们必须对载玻片进行脱蜡和再水化。石蜡去除不完全可能导致切片染色不良。
所需材料
-样品
-二甲苯（例如，X112051）
-乙醇（例如，E111991）
- Coplin罐或自动染色机（例如：Leica ST5020 Multistainer）
步骤
1.使用Coplin罐或自动染色机在二甲苯中清洗载玻片，然后在乙醇中清洗。
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提示：这些步骤可以自动或手动。
您可以使用几种危险性较低的市售二甲苯替代品。请参阅制造商的说明，了解更换乙醇和特定于该试剂的安装程序。
2 .用水清洗载玻片三遍。
3 .将载玻片保持在水中，直到准备好进行抗原修复。
警告：至关重要的是，从这一步开始，任何时候都不要让载玻片变干。干燥会导致非特异性抗体结合，从而导致高背景染色。
第五阶段 抗原修复
大多数福尔马林固定的组织在免疫组织化学染色之前需要抗原修复步骤。固定过程中形成的亚甲基桥交联蛋白质并掩盖抗原位点。
抗原修复方法会破坏这些亚甲基桥并暴露抗原位点，从而使抗体能够结合。
（1）热诱导表位修复（HIER）
在热诱导表位修复（HIER）中，我们将组织切片放入缓冲液中并加热以暴露抗原位点。 HIER最常使用水浴、高压锅或实验室专用微波炉进行。
所需材料
-合适的抗原修复缓冲液（例如：Tris EDTA 缓冲液，E196386）
-您的组织切片，脱蜡并在水中水合
-滑动架可容纳约400 - 500 mL
-加热装置（Decloaking chamber或实验室专用微波炉）
步骤
1.将玻片架浸入含有抗原修复缓冲液的染色皿中。
2 .将染色盘转移到加热装置中并加热载玻片。
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注意：载玻片应放置在塑料或金属架和容器中。标准玻璃组织学染色架和器皿在加热时会破裂。
如果使用实验室专用微波炉，请将温度设置为恒定98℃以避免剧烈沸腾时切片解离。
3 .从容器中取出载玻片并用冷水冲洗10分钟。
提示：这可以使载玻片充分冷却，以便可以对其进行处理，并允许抗原位点在暴露于高温后重新形成。
4 .将载玻片转移回架子上并浸入水中。
-防止载玻片变干非常重要。
（2）酶消化法抗原修复
在酶促抗原修复中，组织切片与胰蛋白酶、胃蛋白酶或蛋白酶K等蛋白酶一起孵育，以暴露抗原位点。可以用移液器直接将酶加到载玻片上，或者可以将载玻片架浸入酶溶液中。
所需材料
-载玻片上的组织切片，脱蜡并在水中水合
-滑动架
-将培养箱设置为最佳温度（通常为37℃）
-酶抗原修复溶液（例如：胰蛋白酶T105532，胃蛋白酶 P128678，蛋白酶 K P274341）
步骤
1 .按照制造商的建议制备酶抗原修复溶液。
注意：最好使用应在抗体数据表上注明的酶。如果没有，可以在福尔马林固定后使用胰蛋白酶恢复各种抗原。
我们的酶抗原修复解决方案可供使用。但是，如果使用其他制造商，请核实相关文献；有些酶需要特定的缓冲液和辅助因子才能发挥活性。
2 .在培养箱中将酶促抗原修复溶液加热至您所使用的酶的最佳温度。
-胃蛋白酶：37℃
-蛋白酶K：室温
3 .用预热的酶抗原修复溶液处理组织切片。
这可以通过以下方式完成：
-将少量（50 -100 µL）酶溶液移至载玻片上，或
-将载玻片架浸入溶液中，在整个步骤4中保持载玻片浸没。
注意：直接移液到载玻片上使用较少的试剂，但需要更仔细的优化以确保载玻片接受相同的处理。
4 .将处理过的载玻片放入培养箱中加热约5 - 10分钟。
-胰蛋白酶：37℃
-胃蛋白酶：37℃
-蛋白酶 K：室温
注意：如果直接移液到载玻片上，请保持培养箱湿润以防止载玻片干燥。您可以使用加湿室来做到这一点。
使用载玻片架以避免将载玻片直接放置在培养箱架上。
通常5-10分钟的孵育时间足以有效，但您可以通过尝试5到30分钟之间的时间范围来优化。
5 .用冷水冲洗载玻片以去除多余的酶。
6 .将载玻片转移到架子上并浸入水中。
-防止载玻片变干很重要。
第六阶段 封闭
现在我们已经准备好载玻片并在需要时进行了抗原修复，样品已准备好进行封闭和抗体孵育。
在IHC中，封闭步骤对于防止图像中的高背景染色尤为重要。封闭内源蛋白对于所有样品都至关重要。
所需材料
- TBST（或1×TBS/0.1% Tween-20，pH 7.4±0.2，如T196392，R397935）
-蛋白封闭液（示例2 -与二抗相同物种的10%正常血清，如，N666060，或无血清蛋白封闭）
-生物素封闭溶液（可选-用于生物素化抗体）
- 3%过氧化氢（可选-用于过氧化物酶偶联抗体
步骤
1 .用TBST清洗载玻片两次。
2 .进行内源性亲和素/生物素封闭（可选）。
2.1将载玻片在亲和素封闭液中室温孵育10分钟。
2.2用TBST清洗载玻片一次。
2.3将载玻片在生物素封闭溶液中室温孵育10分钟。
2.4用TBST清洗载玻片一次。
注意：仅对生物素化抗体执行此步骤。
3 .进行内源过氧化物酶封闭（可选）。
3.1将载玻片与3%过氧化氢在室温下孵育10分钟。
3.2用TBST清洗载玻片一次。
注意：仅对过氧化物酶偶联的抗体执行此步骤。
4 .将载玻片在蛋白质封闭试剂中室温孵育30 - 60分钟。
警告：封闭液不应含有一抗宿主动物的血清，因为这可能会导致高背景。
注意：仅对所有IHC实验执行此步骤。
如果使用血清进行封闭，血清应与二抗的宿主物种相匹配。
5 .用TBST清洗载玻片3次。
6 .继续进行免疫染色。
第7阶段 抗体孵育（免疫染色）
执行必要的封闭步骤后，我们现在准备用抗体对组织样本进行染色。我们可以用偶联一抗直接对组织进行染色，或用偶联二抗间接对组织进行染色。
多色IHC涉及使用两组或多组抗体进行染色，以揭示两种或多种感兴趣蛋白质的分布。下面给出的间接和直接方案均可适用于多色 IHC。我们可以：
-同时用多个抗体组孵育细胞。
-按顺序用每种抗体组孵育细胞，在每次孵育之间进行封闭。
（1）间接染色
所需材料
-已进行相关封闭步骤的组织
- TBST（例如，R397935）
-牛血清白蛋白（例如，B265993）
-一抗
-偶联二抗
-可选：疏水屏障笔
-自动染色机
步骤
1 .稀释TBST中的抗体。
-抗体数据表上通常会建议最佳稀释度。
注意：如果没有，您可能需要进行稀释以找到最有效的抗体浓度。
1% BSA作为附加封闭剂，可减少疏水相互作用引起的非特异性结合。
2 .用预稀释的一抗孵育载玻片。
-将载玻片在4℃下浸入抗体溶液中过夜。
注意：孵化时间可能需要优化。
抗体溶液需要完全覆盖您的样品。
使用疏水性屏障笔可以帮助容纳小体积。
3 .用TBST清洗载玻片3次。
4 .将载玻片在预稀释的二抗中孵育。
-在室温下将载玻片浸入抗体溶液中约10-30分钟。请参阅制造商的指南以了解确切的孵化条件。
提示：可能需要优化孵育时间。
如果使用荧光团，则必须在黑暗中孵育以避免光漂白。
此时也可以进行内源过氧化物酶阻断。
5 .用TBST清洗载玻片3次。
6 .继续复染、封固和成像。
（2）直接染色
所需材料
- 已进行相关封闭步骤的组织
- TBS（例如，T196392）
- 牛血清白蛋白（例如，B265993）
- 偶联一抗
步骤
1 .用1% BSA稀释TBS中的抗体。
-抗体数据表上通常会建议最佳稀释度。
1% BSA作为附加封闭剂，可减少疏水相互作用引起的非特异性结合。
2 .在预稀释的一抗中孵育载玻片。
- 4℃孵育过夜。
抗体溶液需要完全覆盖您的样品。
使用疏水性屏障笔可以帮助容纳小体积。
3 .用TBS清洗载玻片3次。
4 .继续复染、封固和成像。
第8阶段 检测
用抗体孵育后，您现在可以根据以下步骤对载玻片进行成像。
荧光染色
所需材料
- 用荧光团偶联抗体染色的组织玻片
- 荧光复染剂（可选，例如：DAPI，D106471）
- 适用于荧光检测的封片剂
- 密封剂（例如：指甲油或柠檬烯）
- 盖玻片
- 显微镜
步骤
1.将载玻片浸入荧光复染溶液中（可选）。
-根据制造商的指导在室温下孵育或直至观察到所需的颜色。
注意：一些封片剂经过荧光复染剂强化。这消除了额外复染步骤的需要。
2 .用冷水清洗载玻片，去除多余的污渍。
3 .在载玻片上添加几滴适合荧光检测的封固剂。
-让载玻片在室温下静置约5分钟。
注意：使用安装载玻片所需的最小体积。
4 .使用镊子小心地将盖玻片放在载玻片上。
-如果使用水性封片剂，请用柠檬烯或指甲油密封盖玻片。
注意：小心不要引入任何气泡或扰乱样品。
5 .使用显微镜对切片进行成像。
注意：如果不立即使用，请将载玻片储存在4℃的黑暗中。
比色法
所需材料
- 用酶联抗体染色的组织玻片
- 显色底物（HRP示例：DAB D573235）
- 复染（可选）
- 封固剂
- 密封剂（水性封片剂可选，例如指甲油或柠檬烯）
- 盖玻片
- 显微镜
步骤
1.将载玻片与显色底物一起孵育。
-在室温下将载玻片浸入底物溶液中，直至观察到所需的颜色。
注意：根据产品说明书新鲜制备显色底物，并选择合适的染色时间和周期。
在孵育过程中目视监测染色情况。
如果需要，可以在此处用碱性磷酸酶封闭。
2 .用冷水清洗载玻片，去除多余的污渍。
3 .将载玻片浸入复染液中（可选）。
-根据制造商的指导在室温下孵育或直至观察到所需的颜色。
4 .用冷自来水清洗载玻片，去除多余的污渍并使苏木精呈蓝色。
5 .使用乙醇和二甲苯对组织进行脱水。
-在室温下，在Coplin罐中手动或在自动包埋系统中进行以下交换。
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6 .在载玻片上添加几滴封固剂，然后让载玻片在室温下静置5分钟。
注意：使用覆盖载玻片所需的最小体积。
7 .使用镊子将盖玻片放在载玻片上。
-如果使用水性封片剂，请用柠檬烯或指甲油密封盖玻片。
-如果使用有机封固剂，请让介质完全干燥。
注意：小心不要引入任何气泡或扰乱样品。
8 .使用显微镜对切片进行成像。
注意：如果不立即使用，请将载玻片储存在4℃下。
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