染色体原位杂交（in situ hybridization，ISH）技术是指利用特定标记的已知碱基序列的核酸探针，依据碱基互补配对原理，与中期染色体玻片标本中的同源 DNA 序列进行杂交。染色体原位杂交的敏感性高和特异性强，能够对特定核酸序列进行精确定位、定性及相对定量分析。

原理

染色体原位杂交实验的基本原理是利用特定标记的已知碱基序列的核酸探针，依据碱基互补配对原理，与中期染色体玻片标本中的同源 DNA 序列进行杂交。

标记可以用放射性同位素（3H、35S、32P），然后进行放射自显影；也可以用非放射性的荧光素生物素、地高辛，再用荧光显微镜进行观察，即荧光原位杂交（fluorescent in situhybridization，FISH）技术。

操作方法

染色体原位杂交实验

原理

染色体原位杂交实验的基本原理是利用特定标记的已知碱基序列的核酸探针，依据碱基互补配对原理，与中期染色体玻片标本中的同源 DNA 序列进行杂交。标记可以用放射性同位素（3H、35S、32P），然后进行放射自显影；也可以用非放射性的荧光素生物素、地高辛，再用荧光显微镜进行观察，即荧光原位杂交（fluorescent in situhybridization，FISH）技术。

材料与仪器

器材：
① 染色缸
② 微量加样器
③ 荧光显微镜
④ 恒温水浴箱
⑤ 湿盒
⑥ 人中期染色体玻片标本（未染色的白片）
⑦ 人 G显带染色体玻片标本。
试剂：
① 10x 切口平移缓冲液
② 10x 随机引物缓冲液
③ 4x dNTP（各 0.5 mmol/L）
④ 0.2 mmol/L［a-32P］dCTP（10 μCi/μl）
⑤ DNase I（1 mg/mL，用前稀释 1000 倍）
⑥ DNA 聚合酶 I（5 U/μl）
⑦ Klenow 片段（3 U/μL）
⑧ 六碱基随机引物（1 mg/mL）
⑨ 3 mol/L NaAc（pH5.2）
⑩ 70％ 去离子甲酰胺（DF，2x SSC 配制）
⑪ 50％ 去离子甲酰胺（DF，2x SSC 配制）
⑫ 0.5 mol/L EDTA
⑬ RNA酶（1 mg/mL）
⑭ 70 mmol/L NaOH
⑮ 1％ 甲醛（PBS 配制）
⑯ 70％／85％／100％ 梯度乙醇

步骤

染色体原位杂交实验的基本过程可分为如下几步：

（1）切口平移法

A 标记反应总体积为 50 μl，其中含待标记 DNA 探针 1 μg，10x 切口平移缓冲液（成分视试剂盒而定）5 μl，dATP、dGTP、dTTP 各 50 μmol，［α-32P］dCTP（50 μCi）50 μmol，DNase I 5 ng，DNA 聚合酶 I 5 U。

B 将上述试剂加入 0.2 mL Eppendorf 管中，混合均匀后置 16 ℃ 恒温水浴中作用 1 h。用 0.8％ 琼脂糖凝胶电泳检测标记产物。以 DNA 片段长约 300～500 bp 为宜。片段较大，则应加适量 DNaseI 继续酶切，直至 DNA 片段长度适中后，加 2 μl 终止缓冲液（0.5 mol/L EDTA），在 75 ℃ 加热 10 min 终止反应。

（2）随机引物法

A 将待标记 DNA 探针（25 ng）溶于 20 μl 双蒸水中，沸水浴变性 5 min，迅速置冰水混合物中待用。

B 标记反应总体积为 50 μl，其中含待标记 DNA 探针 25 ng，10x 随机引物缓冲液（成分视试剂盒而定）5 μl，dATP、dGTP、dTTP 各 50 μmol，［α-32P］dCTP（50 μCi）50 μmol，六碱基随机引物 10 μg，Klenow 片段 3 U。

C 将上述试剂加入 0.2 mL Eppendorf 管中，混合均匀后置 25 ℃ 恒温水浴中作用 1 h，加 2 μl 终止缓冲液（0.5 mol/L EDTA）终止反应。

随机引物法标记方法简单，产生的放射性标记物产物长度更为均一，在杂交反应中重复性更强。

（3）探针纯化

A 向已标记好的 DNA 探针中加入 3 mol/L NaAc（pH5.2）5 μl，充分混匀，在室温中放置 5～10 min。

B 加入 2.5 倍体积预冷的无水乙醇，充分混匀。

C 置于 4 ℃ 或 -20 ℃ 过夜沉淀。

D 4 ℃，12000 g 离心 30 min，弃掉上清液，空气干燥（不要过分干燥）。

（1）染色体玻片标本的预处理

A 将染色体玻片标本放入 2x SSC 配制的 RNA 酶（10 μg/mL）溶液中，置 37 ℃ 水浴消化 1 h。

B 用 2x SSC 冲洗玻片 3 次，每次 5 min。

C 将玻片依次在 70％／85％／100％ 梯度乙醇中脱水处理各 5 min，空气干燥。

D 将玻片浸在 2x SSC 配制的 70％ 甲酰胺中，于 70 ℃ 变性 2 min。

E 将玻片依次在 70％／85％／100％ 梯度乙醇中脱水处理各 5 min，空气干燥。

（2）杂交

A 每张染色体玻片标本加杂交液 20～50 μl，加盖盖玻片（事先经硅烷化处理），橡胶水泥封片。

B 将玻片置于湿盒中，37 ℃ 杂交过夜。

C 取出杂交玻片，去除封片剂和盖玻片，用 39 ℃ 预热的 50％ 去离子甲酰胺（2x SSC 配制）冲洗 10 min。

D 用 39 ℃ 预热的 2x SSC 冲洗玻片 10 min。

E 将玻片依次在 70％／85％／100％ 梯度乙醇中脱水处理各 5 min，空气干燥。

注意事项

1 探针纯化时，不要用涡旋振荡器混合试剂。

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