SV40 的体外包装: 一种假病毒体基因递送系统
SV40 的体外包装: 一种假病毒体基因递送系统
感染了杆状病毒的草地贪夜蛾（Sf9 ) 昆虫细胞的细胞核提取物编码猿猴病毒40(S V 4 0 ) 的主要外壳蛋白（V P l )。在 有 M g C l 2、 CaCl2 和 A T P 存在时，这些核提取物能包装超螺旋结构的质粒D N A 或 R N A 干 扰 （R N A i ) 序列，从而在体外形成S V 40假病毒体。这种包装方法和其他病毒或非病毒传递系统相比有许多优点。特别是它拥有广泛的宿主范围和髙转化率。这个系统唯一的缺点是体外观察到每个转化细胞的表达量过低 ，可能是由于产生的D N A 被限制在细胞质中，不能进入到细胞核内。作者：T.弗里德曼等,译者：殷勤伟等，本实验来自「基因转移」
操作方法
SV40体外传递系统 步骤 S V 4 0 体 外 传 递 系 统 材料 试剂 A T P (10 0 m m o l/ L ；R oche) 缓冲液 I 10 m m o l/L H E P E S (p H 7. 9) 10 m m o l/L K C l 0.lm m o l/L E D T A 0 . 1 m m ol/L E G T A 用 0.22um 滤膜过滤灭菌。缓冲液 I 能在 4°C 保存 30d。 使用前加入： l m m o l / L 二硫苏糖醇（D T T ) 在 Iml PBS 中溶解 1 片蛋白酶抑制剂（ Roche 1873580 ) , 用缓冲液 I 1 :50 稀释。 缓冲液 II 20m m o l / L H E P E S ( p H 7. 9) 0.4m m o l / L NaCl 0.l m m o l / L E D T A l m m o l / L E G T A 用 0.22um 滤膜过滤灭菌。缓冲液 II 能在 4℃ 保存 30d。 使用前加入： l m m o l / L P M S F l m m o l / L D T T 在 Iml PBS 中溶解 1 片蛋白酶抑制剂（ Roche 1873580 ) ，用缓冲液 11 :50 稀释 CaCl2 (10 mmol/L) 细胞 用于研究的细胞系 在培养皿或悬浮维持要转化的细胞系。 草 地 夜 蛾（Sf9 ) 细胞 培养基 细胞生长培养基（含有乳清蛋白和 yeastolate 的 G r a c e 昆虫培养液） 完全生成培养基 使用所研究细胞系合适的培养基。 M g C l 2 (200m m o l /L ) Nonidet P -40 (N P -40； 1 0% V /V in P B S ) 磷酸盐缓冲液（P B S ) 质粒 D N A (可达17. 7k b) 要获得最高体外包装效率，使 用 C s C l —氯化铯密度梯度平衡离心纯化质粒 D N A 。 小 干 扰 R N A (s i R N A ) V P l 杆状病毒 通过引人一’个 DNA 片段（SV40 上 1463^〜2770) 到由 Aw 吨 ra 灿 a cW/omicanuclear pholyhedrosis 病毒（AcMNPV) 衍生（Luckow and Summers 1988) 的 pVL1393 质粒（PharMingen， San Diego, California) 中，进行 VPl 的克隆（PharMingen， San Diego, 仪器 培 养 箱（恒湿， 37°C ， 5 % C O 2) 离 心 管（40m l ，无菌， Sorvall) 微 型离心管（1.5m l ) 摇床 搅拌培养瓶（250m l ) 组织培养皿（60m m ) 有微型离心管平台的涡旋混合器 恒 温水浴锅 （37°C ) 方法 转化 Sf9 细胞 1.在 250m l 培养瓶中，以感染复数为 1 0 的 V P l 杆状病毒感染新鲜培养的 5 X 1 〇8 Sf9细胞。 不建议放大到 500 ml。 核蛋白提取 感 染 后 4〜5d 收 集 Sf9 细胞。收获细胞的时间由 vpl 的表达水平及核提取物的包装功能决定。 2•把转化后的细胞从 250m l 培养瓶转移到预冷的 40m l 试管中。 3•准备缓冲液 I 和 II。放置在冰上。预冷微型离心管。 4.用 冷 的 P B S 清洗细胞三次，每次在 4°C ， 6000r/m i n 离 心 5m i n 。 5•去上清。涡旋使沉淀完全重悬 这一步不要冷冻。 6•加入 I m l 缓冲液 I。轻轻吹打使沉淀重悬直到完全分散。 7.慢慢加人 28m l 缓冲液 I。在冰上孵育 15m i n 。 8•加人 2. 3m l 10% N P -40。涡旋混合 10s。 9•在冷冻离心机 （约 4°C ) 中 13 000r/m i n 离 心 3m i n 。 10.用连接真空吸气器的吸头去除上清。 、细胞核内物质在沉淀中。 11•涡旋振荡沉淀。加 人 5m l 缓冲液 II。充分混合后转移到微量离心管中。 每管的总体积本要超过 lml。 I2. 把管子放在连接到振荡器的平台上。 4°C 涡旋混合 15m i n 。 13.4 C ， 13 000r/m i n 离心微量离心管 5m i n 。 14•将核提取物上清分装到预冷的管子里。 15•测定核提取物的蛋白质浓度。 注意到核提取物含有 N P -4 〇。并不是所有测定蛋白质浓度的方法都和 N 1m o 兼容。只有当浓度起过 3m g /m l 才能用于体外包装。 16• 在 一 20〜一 8℃ 储存核提取物。 如需了解更多产品详情，请前往阿拉丁官网查询。
0.5m m o l / L phenylmethylsulfonyl fluoride (P M S F )
California) 。然后经限制性内切核酸酶 SmaI 和 BgZII (Sandalon and Opperiheim 1997,2001) 消化。分装病毒储液，保存在一 80°C 中。
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