DNA的克隆是指在体外将含有目的基因或其它有意义的DNA片段同能够自我复制的载体DNA连接，然后将其转入宿主细胞或受体生物进行表达或进一步研究的分子操作的过程，因此DNA克隆又称分子克隆，基因操作或重组DNA技术。

操作方法

基本方案

材料与仪器

DNA
TE 核苷三磷酸混合液 RNA聚合酶缓冲液 异丁醇 NaOH TCA
离心机 摇床

步骤

1.  亚克隆编码蛋白质的目的DNA片段于质粒载体的SP6或T7启动子的下游。   2.  通过CsCl/溴化乙锭离心或PEG沉淀制备质粒DNA。   3.  用位点在终止密码子的立即下游处（理想是50~200碱基）而不存在于蛋白质编码区中的限制性内切酶切割DNA。取小份样品在琼脂糖凝胶电泳中检测。

4.  酚抽提及乙醇沉淀纯化DNA，重溶于50 μl TE缓冲液。   5.  在室温建立如下的25 μl 的反应混合液（避免精胺使DNA模板沉淀） 8 μl  H₂O
5 μl  DNA
5 μl  5×核苷三磷酸混合液
2.5 μl  10×SP6或T7 RNA聚合酶缓冲液
2.5 μl 10 mmol/l 精胺
1 μl  RNAsin
1 μl  SP6/T7 RNA聚合酶
于40℃保温60 min，如用T7 RNA聚合酶反应，不加精胺，补加2.5 μl 水。   6.  加入25 μl 缓冲液平衡酚，振荡混匀，立即抽提。转移水相于一个新微量离心管中，以异丁醇抽提两次。加入6 μl 10 mol/l 乙酸铵和70 μl 乙醇，沉淀RNA并以乙醇洗1次。

7.  重溶RNA于24 μl TE缓冲液，加入6 μl 10 mol/l 乙酸铵和70 μl 乙醇，沉淀RNA并以乙醇洗1次。重溶RNA沉淀于10 μl TE缓沖液，RNA应立即进行体外转录或急冻后存于-70℃。   8.  按厂商的说明书往体外翻译试剂盒的配套试剂加入1~10 μl RNA。加入15 μCi［³⁵S］标记甲硫氨酸，典型的反应在30 μl 体枳室温进行30~60 min。反应完成后，可在0~4 ℃保存1周。

9.  取1 μl 翻译反应的产物加入到50 μl 0.1 mol/l NaOH，于37℃放置15 min 加入1 ml，10%TCA在冰上放置15 min。将沉淀收集于玻璃纤维滤膜上，用液闪计数仪测定大量掺入的［³⁵S］甲硫氨酸。

10.  取3 μl 翻译反应产物，用单问SDS-PAGE电泳包括蛋白质分子量标准。用 EN³HANCE荧光自显影使［³⁵S］蛋白质显迹和放射自显彩1~4 h。

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