技术文章

AF系列荧光染料简介，应用及选型指南

· · 发布于 2025年12月11日 · 更新于 2025年12月11日 ·

AF 染料概述

AF系列是以罗丹明、花菁（cyanine）、香豆素等传统荧光母核为基础，经高度磺酸化改造得到的一类新一代荧光染料。引入多个磺酸基团（–SO₃⁻）后，染料分子带负电、亲水性大幅提升，水溶性显著优于传统染料，标记蛋白后不易聚集沉淀。

AF系列覆盖从紫外到近红外的光谱范围，包括 AF350、405、430、488、532、546、555、568、594、647、660、680、700、750 等多个波长，能够满足绝大部分流式、荧光显微及成像平台的多色实验需求。

“AF + 数字”中的数字大致对应该染料的主要激发/吸收峰或常用激光线波长。例如：

AF 488 适配 488 nm 激光；
AF 555 适配 532/561 nm 激光；
AF 647 适配 633/640 nm 激光。

在光谱上，AF 染料与常见传统荧光染料具有良好对应关系，例如：

AF 350 ≈ AMCA/AMCA-X
AF 405 ≈ Cascade Blue / Pacific Blue
AF 430 ≈ Lucifer Yellow 等
AF 488 ≈ FITC、Cy2
AF 555 / AF 568 ≈ Cy3、罗丹明类
AF 594 ≈ Texas Red
AF 647 / AF 660 ≈ Cy5
AF 680 / 700 / 750 ≈ Cy5.5 / Cy7 等

因此在既有滤光片和激光配置的仪器上，往往可以直接以AF染料替代传统荧光团，而无需调整光学系统。

AF 的核心优势

1. 高亮度

AF染料通常具有较高的摩尔消光系数和适中的量子产率，很多波长段的综合亮度明显优于传统染料：

例如 AF 488 的量子产率约 0.9，AF 568、AF 594 也具有较高的量子产率和消光系数。

与FITC、Cy3、Cy5等传统染料相比，同等标记度下AF偶联物信号更强，有利于检测低丰度靶标或缩短曝光时间。

2. 优异的光稳定性

多种AF染料在持续激发条件下表现出更低的光漂白速率，可显著延长荧光显微和活细胞成像的可用时间。

AF 555 被证实比 tetramethylrhodamine 和 Cy3 更耐光漂白；
AF 647、AF 568 等也被广泛用于高要求的STED/STORM等超分辨显微实验。

3. 宽广的 pH 适应范围

许多AF染料在pH 4–10范围内荧光信号基本不受影响，例如 AF 488、AF 405 等，这一点明显优于对pH敏感的 fluorescein 等传统染料。

这使得AF染料可以用于酸性胞器、胞外环境甚至某些固定/封片条件下仍保持稳定信号。

4. 优良的水溶性和低非特异性结合

多磺酸基团带来的高极性，让AF染料及其偶联物在水相中具有良好溶解度，减少了对有机溶剂的依赖，也降低了因染料疏水性导致的：

蛋白聚集或沉淀；
染料分子之间的堆积淬灭；
非特异性疏水吸附。

对抗体、蛋白质偶联尤其有利，有助于维持蛋白构象与生物活性。

5. 仪器兼容性与多色组合

AF系列在设计时充分考虑了与常见激光线（355、405、488、532、561、594、633/640 nm 等）的匹配，大多数染料都能在现有流式细胞仪和荧光显微镜上直接使用。

同时，从蓝光到近红外的密集波长覆盖，配合窄带滤光片，可构建高达8色甚至10色以上的多色检测panel。

AF标记原理

1. 赖氨酸随机标记（NHS 酯）

最常见的AF标记方式是使用NHS酯（N-hydroxysuccinimide ester，琥珀酰亚胺酯）：

条件：一般在pH 7.5–8.5的缓冲液中进行；
机理：NHS酯被蛋白质的伯胺（赖氨酸侧链 –NH₂ 或 N 端氨基）亲核攻击，释放 N-羟基琥珀酰亚胺，生成稳定的酰胺键，将染料共价连接到蛋白上。

该方法简单、通用，适合大部分抗体和蛋白质的常规制备。但由于不同蛋白赖氨酸数量和表面分布差异，同一工艺在不同蛋白之间、甚至同一蛋白不同批次之间，可能导致标记度、活性影响程度存在差异。

2. 巯基特异性标记（Maleimide）

对于含半胱氨酸残基的蛋白，可使用马来酰亚胺（Maleimide）型AF染料，在温和条件下与自由巯基发生Michael 加成反应，形成稳定的硫醚键：

适用于还原或工程化引入特定Cys位点，实现较高的位点特异性；
常用于构建均一度更高的荧光抗体、重组蛋白探针等。

3. Click Chemistry 体系（Azide / Alkyne / DBCO / Tetrazine）

针对需要更高位点精确度或可控间隔臂结构的项目，可采用生物正交反应：

(1) Azide / Alkyne：

传统 Cu(I)-催化的Huisgen环加成（CuAAC）；
适用于在非生理条件下的体外标记；

(2) DBCO / BCN 等应变炔：

无铜点击反应用于活细胞或体内标记，避免铜离子毒性；

(3) Tetrazine / TCO：

速率极快的逆电子需求Diels–Alder反应，适合作为体内实时成像与高效偶联手段。

通过先在靶蛋白、抗体或细胞表面引入对应“手柄”（azide、alkyne、TCO 等），再使用带有互补官能团的AF染料进行Click反应，可以实现真正意义上的定点标记。

4. 定点标记的重要性

在 CAR-T、ADC、双抗等药物开发中，荧光标记蛋白不仅仅是“能亮”即可，更需要：

保持蛋白/抗体与靶标的亲和力与特异性；
批间一致性高，利于方法学与质控；
标记位点远离功能结构域，减少构象干扰。

因此，在常规NHS随机标记之外，引入工程化氨基酸位点 + 巯基/Click 等定点标记策略，是获得高质量 AF 荧光标记蛋白的关键步骤之一。

典型应用场景

凭借高亮度、高稳定性和多色组合能力，AF染料已成为生命科学和生物药开发领域的主流荧光工具之一：

1. 流式细胞术（Flow Cytometry）

表面/胞内蛋白标记；
CAR-T 细胞阳性率检测（如AF488/AF647抗体标记）；
免疫表型分析、多色Panel设计。

2. 荧光显微和共聚焦成像

免疫荧光（IF）、细胞骨架、线粒体等亚细胞结构标记；
组织切片IHC/IF，配合AF594/AF647进行多重染色。

3. 超分辨显微（STED/STORM/SIM）

AF647、AF568等远红染料适用于STORM/STED；
AF405 等短波染料用于光激活/光转换。

4. PK / 生物分布与体内成像

利用AF680/700/750等近红外染料，对抗体、蛋白质药物、纳米载体进行标记，开展动物体内药代动力学和组织分布研究。

5. 细胞治疗与生物药开发

用AF标记的靶点蛋白作为标准品或检测试剂，在CAR-T细胞构建、效价评估、IHC分布、双抗/ADC 亲和力检测等多个环节发挥关键作用。

AF染料反应性衍生物清单表

系列	反应基团类型	品名（简写）	英文全称	阿拉丁货号	级别和纯度	CAS 号	产品特点（简述）	典型应用
AF405	NHS 酯（胺反应）	AF405 NHS ester	AF 405 NHS ester	C378965	Ex:401nm Em:422nm	-	蓝色 AF405 活化酯；Ex/Em ≈401/422 nm，pH 4–10 基本稳定，水溶性好	短波通道多色成像；蛋白/抗体胺标记；流式与 405 nm 紫激光配套使用
AF430	羧酸	AF430 COOH	AF 430 carboxylic acid / Alexa Fluor 430 Acid	A1451486	-	780740-46-7	AF430 核 + 羧酸；蓝光激发、绿黄发射，水溶性好	自建活性酯、固相偶联、多色成像
AF430	NHS 酯（胺反应）	AF430 NHS ester	AF 430 NHS ester	A1454256	-	467233-94-9	经典胺反应型；适合一次性做成“通用标记试剂”	抗体/蛋白赖氨酸随机标记，细胞染色、流式
AF430	胺	AF430 NH₂	AF 430 amine	A1451911	-	-	末端伯胺，可与活性酯、醛基等进一步偶联	二次衍生化、交联剂拼接、纳米材料表面修饰
AF430	Maleimide（巯基反应）	AF430 Mal	AF 430 maleimide	A1451803	-	-	巯基特异，AF430 作为供体/报告染料	Cys 定点标记、酶活性探针
AF430	Azide（Click）	AF430 N₃	AF 430 azide	A1453546	-	-	叠氮基；适用于 CuAAC/SPAAC	代谢标记 Click 标记、核酸/糖类探针
AF430	Alkyne（Click）	AF430 alkyne	AF 430 alkyne	A1453271	-	-	端炔；与叠氮底物 Click 连接	小分子示踪、点击修饰聚合物
AF430	Tetrazine（Click）	AF430 tetrazine	AF 430 tetrazine	A1453580	-	-	IEDDA Click，高速、无需铜催化	细胞/体内无铜点击，活体追踪
AF488	羧酸	AF488 COOH	AF 488 carboxylic acid	-	-	-	经典 488 nm 绿色染料的羧酸型，水溶好	自制活性酯、偶联小分子、纳米颗粒
AF488	NHS 酯（胺反应）	AF488 NHS ester	AF 488 NHS ester	A684772	-	1374019-99-4	与 FITC 光谱相近但更亮、更稳定；胺反应首选	抗体/蛋白标记、流式、免疫荧光
AF488	NHS 酯（胺反应型，TEA 盐）	AF488 NHS ester (TEA salt)	AF 488 NHS ester (TEA salt)	A1455666	-	-	经典 AF488 NHS 活化酯的 TEA 盐型，绿色高亮、光稳定，在 pH 7.5–8.5 条件下与伯胺形成稳定酰胺键。	抗体/蛋白/寡核苷酸伯胺标记，用于流式、免疫荧光、共聚焦成像等。
AF488	NHS 酯（胺反应型，diTEA 盐）	AF488 NHS ester (di-TEA salt)	AF 488 NHS ester (di-TEA salt)	A1451902	-	-	AF488 NHS ester 的二三乙胺盐型，提高水溶性和配方兼容性，反应活性与普通 AF488 NHS ester 相同。	同上，用于需要更高水溶性或特殊缓冲体系的胺标记。
AF488	伯胺型（可继续偶联）	AF488 amine	AF 488 amine	A1454100	-	-	末端带伯胺的 AF488 染料，可与 NHS 酯、活化羧酸或醛基进一步偶联，方便自定义连接臂和偶联结构。	自制交联物、偶联小分子/多肽/聚合物、纳米材料表面修饰等。
AF488	Click – Azide（叠氮，双TEA）	AF488 azide（bis-TEA salt）	AF 488 azide, bis(triethylammonium) salt	A598144	≥90%(HPLC)	1006592-64-8	双三乙铵盐，水溶性和批次一致性更好	高要求 Click 标记（需要结构明确和良好溶解性），如精确定量标记、标准品制备等。
AF488	Azide（Click）	AF488 N₃	AF 488 azide	A1454880	≥99%	-	绿色通道通用 Click 叠氮底物	代谢标记 Click 染色、蛋白/糖类示踪
AF488	已标记蛋白（Streptavidin）	AF488 streptavidin	AF 488 streptavidin conjugate	A1454237	-	-	AF488 已偶联链霉亲和素，非“小分子反应性染料”，可直接与生物素标记的一抗、寡核苷酸等配合使用。	ELISA、免疫印迹、免疫荧光和流式中作为“AF488-链霉亲和素”二抗/放大系统使用。
AF488	Alkyne（Click，5-位）	AF488 alkyne	Alexa Fluor 488 alkyne	-	-	-	明确 5-位异构体，结构更单一	与叠氮底物 CuAAC；构建定义明确的探针
AF488	DBCO（无铜 Click）	AF488 DBCO	Alexa Fluor 488 DBCO	A1454553	-	-	应用于 SPAAC 无铜 Click，细胞相容性佳	与含叠氮基的蛋白、核酸、多糖、纳米颗粒等进行无铜 Click 标记，用于活细胞/动物成像及分子示踪。
AF488	DBCO（无铜 Click）	AF488 DBCO（ditriethylamine）	Alexa Fluor 488 DBCO, di-triethylamine salt	A1455309	-	-	AF488 DBCO 的三乙胺盐形式，溶解性进一步提升，功能上等同于 AF488 DBCO。	同上，用于对叠氮标记的生物分子进行无铜 Click 标记。
AF488	Maleimide（C5 间隔臂）	AF488 C5 Maleimide	Alexa Fluor 488 C5 Maleimide	-	-	-	带 C5 spacer 的巯基反应染料，减小结构位阻	Cys 定点标记、蛋白构象/动力学研究
AF555	NHS 酯（胺反应）	AF555 NHS ester	Alexa Fluor 555 NHS ester	A1454787	-	407627-68-3	橙红色 AF555 活化酯；水溶性好，在 pH 7.5–8.5 条件下与伯胺形成稳定酰胺键；适合替代 Cy3/TAMRA	抗体标记后亮度和光稳定性优于传统染料
AF555	Azide（Click）	AF555 azide	Alexa Fluor 555 azide	A1454053	-	-	AF555 的叠氮衍生物；可通过 CuAAC 或 SPAAC 与炔基底物进行高效点击反应；保持AF555高亮度和良好水溶性	炔修饰抗体、蛋白、多肽、寡核苷酸的 Click 标记；活细胞或体内示踪、多色成像
AF555	羧酸	AF555 carboxylic acid	Alexa Fluor 555 carboxylic acid	A1451009	-	-	橙红色 AF555 羧酸型；极高亲水性，适合作为标准品或用于自制活性酯/交联物	自建 NHS 酯或其他衍生物；小分子、纳米颗粒或聚合物的共价接枝；荧光标准曲线
AF568	羧酸	AF568 carboxylic acid	Alexa Fluor 568 carboxylic acid / AF568 COOH	A1454255	-	1613725-54-4	橙红通道，高消光系数，pH 4–10 稳定	制备自有衍生物、多色免疫荧光、FRET 受体/供体
AF568	NHS 酯（胺反应）	AF568 NHS ester	Alexa Fluor 568 NHS ester	A1454428	-	247145-38-6	抗体/蛋白红橙色标记常用染料，抗光漂白	共聚焦成像、流式、IHC/IF 多重染色
AF568	Alkyne	AF568 alkyne	Alexa Fluor 568 alkyne	A1453544		-	橙红通道 Click-炔基	与 AF568-azide 搭配 Click；小分子/寡核苷酸标记
AF568	Azide	AF568 azide	Alexa Fluor 568 azide	A1452858	-	-	适合结构精细要求的项目	IEDDA 预修饰载体后再 Click 标记、代谢示踪
AF568	Click – DBCO（无铜）	AF 568 DBCO	Alexa Fluor 568 DBCO	A1454589	-	-	AF568 橙红荧光，与 DBCO 张应力炔结合；适合无铜 SPAAC 点击反应，细胞和体内相容性好	无铜点击标记；活细胞/动物体内成像，多色荧光标记及分子追踪等
AF594	NHS 酯（胺反应型，混合异构）	AF594 NHS ester	Alexa Fluor 594 NHS ester	C378964	≥95%	295348-87-7	Texas Red 替代，红色通道，水溶性好	抗体/蛋白标记，多重 IHC/IF、流式红色通道
AF594	Click – DBCO（无铜）	AF594 DBCO	Alexa Fluor 594 DBCO	A1449927	-	-	与DBCO张应力炔结合；适合 SPAAC 无铜点击，水/有机中易溶，细胞与体内体系兼容性好。	无铜 Click 标记，用于荧光成像和流式检测。
AF594	Click – Azide（叠氮）	AF594 azide	Alexa Fluor 594 azide	A1450239	-	1872449-19-8	Alexa Fluor 594 azide，红色叠氮 Click 染料，经 CuAAC 与端炔反应	适合蛋白、小分子、纳米载体的点击标记。
AF647	羧酸	AF647 COOH	Alexa Fluor 647 carboxylic acid / AF647 acid	A1454404	-	407627-58-1	远红染料羧酸型，背景低、穿透力强	构建 AF647-NHS / Click 衍生物，作为参考标准品
AF647	NHS 酯（胺反应）	AF647 NHS ester	Alexa Fluor 647 NHS ester / AF647-NHS ester	A1454424	-	-1620475-28-6	Cy5 替代，Ex/Em ~651/672 nm，消光系数高	CAR-T 相关流式、IHC、抗体偶联药物探索
AF647	胺	AF647 NH₂	Alexa Fluor 647 amine	-	-	-	远红 AF 核 + 胺基；可进一步活化或偶联	与 NHS 酯、异硫氰酸酯等反应，自制探针
AF647	Maleimide（巯基反应）	AF647 Mal	Alexa Fluor 647 Maleimide	-	-	1825332-75-9	远红巯基特异染料，适合低背景、高灵敏需求	Cys 定点标记、蛋白定位、活体/长时间成像
AF647	Azide（Click）	AF647 N₃，triethylammonium salt	AF647 Azide, triethylammonium salt	A598143	BioReagent ≥90%(HPLC)	-	远红 Click-叠氮；适合铜/无铜双模式体系	代谢标记 Click 显色、体内示踪
AF647	Alkyne（Click）	AF647 alkyne	Alexa Fluor 647 alkyne	-	-	-	远红 Click-炔基，用于与多种叠氮底物连接	多价探针构建、表面修饰
AF647	DBCO（无铜 Click）	AF647 DBCO	Alexa Fluor 647 DBCO	-	-	-	SPAAC 无铜点击，细胞/动物体系兼容性高	体内生物正交标记、ADC/纳米药物构建
AF647	Me-Tetrazine（IEDDA Click）	AF647 Me-Tetrazine	Alexa Fluor 647 Me-Tetrazine	-	-	-	与TCO/BCN 等超快 IEDDA 反应，极适合活体成像	预靶向成像、in vivo Click 体系、多步标记
AF660	NHS 酯（胺反应）	AF660 NHS ester	Alexa Fluor 660 NHS ester	A598199	BioReagent ≥90%(HPLC)	-	远红AF660 活化酯；Ex/Em 约668/698 nm，光稳定性好，背景低，适合深部组织和多色panel 远红通道	抗体/蛋白远红标记；流式 633/640 nm 激光通道，多色免疫表型；组织切片和体内成像
AF680	NHS 酯（胺反应）	AF680 NHS ester	Alexa Fluor 680 NHS ester	A1452612	-	407628-15-3	近红外 AF680 活化酯；Ex/Em ≈679/702 nm，自发荧光干扰小，穿透力强	抗体、蛋白药物、纳米载体的 NIR 标记；小动物体内成像、PK/生物分布实验
AF700	NHS 酯（胺反应）	AF700 NHS ester	Alexa Fluor 700 NHS ester	A638844	Ex:696nm Em:719nm	-	近红外 AF700 活化酯；Ex/Em ≈702/723 nm，光稳定性好，适合远红/近红外通道扩展 panel	远红/近红外多色流式 panel；在体或 ex vivo 组织成像；与 AF647/680 组合构建 8–10 色以上检测

阿拉丁：https://www.aladdin-e.com/

目录：技术文章

探索主题： AF系列染料

Da — 若无特别说明，分子量单位默认为道尔顿。 Mw — 重均分子量。 Mn — 数均分子量。

产品仅供科研与开发使用，不用于人体、动物、诊断或治疗。

引用本文

阿拉丁科学.《AF系列荧光染料简介，应用及选型指南》. 阿拉丁知识库，更新于 2025年12月11日。
                            https://www.aladdin-e.com/zh_cn/faqs/introduction-to-the-alexa-fluor-af-series-fluorescent-dyes.html

这篇文章对您有帮助吗？ Yes No 有 3 人觉得有帮助

引用本文

相关产品