植物叶绿体的分离制备是具有活性的离体叶绿体是研究叶绿体结构功能和光合作用机理的重要技术条件。本实验学习分离制备叶绿体的技术方法。

原理

植物叶绿体的分离制备的基本原理是由于叶绿体具有相对固定的大小、形状和密度，从而决定了在分部离心时其具有特殊的下沉速度。利用叶绿体直径和沉降系数与其他细胞器不同的特点，通过离心机进行分级分离。研磨叶片得到的匀浆，经过滤、离心可制备叶绿体。叶绿体的被膜比较脆弱，分离叶绿体应在等渗的缓冲溶液中，0~4 ℃ 温度下进行。叶绿体活力会随着离体时间延长而不断下降，因此，分离工作尽可能在短时间内完成。

操作方法

植物叶绿体的分离制备

原理

植物叶绿体的分离制备的基本原理是由于叶绿体具有相对固定的大小、形状和密度，从而决定了在分部离心时其具有特殊的下沉速度。利用叶绿体直径和沉降系数与其他细胞器不同的特点，通过离心机进行分级分离。研磨叶片得到的匀浆，经过滤、离心可制备叶绿体。叶绿体的被膜比较脆弱，分离叶绿体应在等渗的缓冲溶液中，0~4 ℃ 温度下进行。叶绿体活力会随着离体时间延长而不断下降，因此，分离工作尽可能在短时间内完成。

材料与仪器

材料：菠菜或其他绿色植物新鲜叶片。
试剂：
分离介质含 0.33 mol・L
-1
山梨醇，50 mmol ・L
-1
Tris-HCl（或 Tricine） pH 7.6，5 mmol・L
-1
MgCl
2
，10 mmol・L
-1
NaCL，2 mmol・L
-1
EDTA-Na
2
，2 mmol・L
-1
异抗坏血酸钠。
配法：
称 60 g 山梨醇、6.06 g Trisa，1 g MgCl
2
・6H
2
O、0.6 g NaCl、0.77 g ED1A-Na
2
，0.4 g 异抗坏血酸钠，溶解后用 1 mol・L
-1
HCI 调 pH 至 7.6，定容至 1 000 mL。
测定介质 Ⅰ：含 0. 66 mol・L
-1
山梨醇，2 mmol・L
-1
MgCl
2
，2 mmol・L
-1
MnCl
2
・4 mmol・L
-1
EDTA-Na
2
，10 mmol・L
-1
焦磷酸钠。100 mmol・L
-1
Tris-HCl pH7.60。
配法：
称 60 g 山梨醇、0.2 g MgCl
2
・6H
2
O、0.2 g MnCl
2
・4H
2
O、0.75 g EDTA-Na
2
、2.23 g Na
4
P
2
O
7
・10H
2
O、6.06 g Tris，溶解后用 1 mol・L
-1
HCI 调 pH 至 7.6，定容至 500 mL。
测定介质 Ⅱ：将测定介质 Ⅰ 稀释 1 倍。
分离介质可用：0. 35 mol・L
-1
NaCl + 0.01 mol・L
-1
Tris pH7. 6 缓冲液。
器材：
① 冰箱；
② 离心机；
③ 天平；
④ 显微镜；
⑤ pH 计；
⑥ 研钵；
⑦ 量筒；
⑧ 移液管；
⑨ 离心管；
⑩ 脱脂纱布等。
分离器皿都须在 0 ℃ 下预冷。

步骤

植物叶绿体的分离制备的基本过程可分为如下几步：

1. 选用生长健壮，最好是连续几个晴天下生长的菠菜叶片，洗净后去除叶柄和中脉。

2. 取冷却的菠菜叶片 10 g，撕碎后放入研钵，研磨时加入 20 mL 0.35 mol・L^-1 NaCl，2 mL 0. 01 mol・L^-1 Tris 缓冲液（或分离介质）及少量石英砂。手工快速研磨 30~60 s，注意不要用力过猛，也不必研磨过细，以叶片磨成小块时即可，研磨后将匀浆用 4 层新纱布过滤。

3. 将滤液装入预冷过的两个离心管，经天平平衡后，用离心机，以 1 000 r・min^-1 离心 2 min，弃沉淀。

4. 上清液在 3 000 r・mir^-1 离心 5 min，弃去上清液，沉淀即为叶绿体。

5. 将沉淀分成两份，分别用 0.35 mol・L^-1 NaCl 溶液和 0.035・L^-1 NaCl 溶液各 10 mL 悬浮，使叶绿体分别处于等渗溶液、低渗溶液中，即得到完整叶绿体和破碎叶绿体。

6. 用滴管吸取少量完整叶绿体或破碎叶绿体悬浮液，加少量测定介质 Ⅱ 稀释，置显微镜（400〜600 倍）下，观察叶绿体的形态。

注意事项

1. 叶片研磨时速度要快，迅速离心。

2. 制备叶绿体悬液时，加入悬浮介质速度要缓慢，以便保持叶绿体的完整度。

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