本实验目的是掌握盐溶法大量制备动物基因组DNA 的基本原理和方法，根据核糖核蛋白与脱氧核糖核蛋白在一定浓度的氯化钠溶液中的溶解度不同进行分离, 然后用蛋白质变性沉淀剂去除蛋白,使核酸释放出来, 再利用核酸不溶于乙醇的性质将核酸析出, 达到分离提纯的目的。

操作方法

盐溶法

原理

根据核糖核蛋白与脱氧核糖核蛋白在一定浓度的氯化钠溶液中的溶解度不同进行分离, 然后用蛋白质变性沉淀剂去除蛋白,使核酸释放出来, 再利用核酸不溶于乙醇的性质将核酸析出, 达到分离提纯的目的。在0 . 14 mol/ L 的氯化钠溶液中, RNA 核蛋白(RNP) 溶解度大, 而DNA 核蛋白( DNP) 溶解度较小; 相反, 在1 mol/ L的氯化钠溶液中, DNP 溶解度最大, 而RNP 溶解度却很小, 从而使DNA、RNA 核蛋白分开。核蛋白分离后可用蛋白变性沉淀剂( 氯仿+ 异戊醇、十二烷基硫酸钠、热酚等) 去除蛋白质, 释放核酸, 核酸便从溶液中析出。动物肝中含有核糖核酸酶( RNase ) 和脱氧核糖核酸酶(DNase ) , 因此要保持低温, 要防止Mg2+, Fe2+及Co2+等激活离子。

材料与仪器

蛋白质
柠檬酸钠 氯化钠 蒸馏水 盐酸 SDS 乙醇 氯仿 异戊醇
冷冻离心机 组织捣碎机 烧杯 量筒 玻璃棒 三角烧瓶 离心管

步骤

新鲜猪肝4 g , 用SC 溶液洗去血液, 低温剪碎后, 加入8 ml上述溶液, 继续捣碎, 将匀浆物于4000 r/ min 离心10 min , 上层是RNP 提取液, 下层是DNP 及细胞碎片。将上层倾出( 也可留下制备RNA) , 下层再用5 ml SC 溶液重复抽提两次, 以减少RNP 对DNP 抽提的影响。   下层沉淀移入三角烧瓶, 加同上溶液20 ml , 混匀, 加4 ml 5% SDS 混匀, 加15 ml 氯仿/ 异戊醇( 20/ 1 ) 混合液混匀,边摇边加固体氯化钠, 使其终浓度达1 mol/ L, 充分振荡30 min。4000 r/ min 离心20 min , 小心取出离心管, 观察有三层, 上层为水相( DNA 溶解在此) , 中间乳白色为蛋白质沉淀层, 下层为氯仿层。用吸管小心吸取上层。同样方法去蛋白, 至中间层无蛋白沉淀层为止。   量取上层水相体积后, 在烧杯中加等体积冷乙醇( 95%) ,边加边搅拌(沿一个方向) , 玻璃棒上有纤维状DNA 缠绕, 当DNA 全部绕上后, 挤干, 再用无水乙醇洗一次, 取出于干燥器干燥。称重, 计算得率。

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