通过让两个互补的引物退火构建接头，首先应使引物 1B 和 2B 的 5'末端磷酸化。

现代神经科学研究技术

作者：U.Windhorst & H. Johansson 翻译：赵志奇 陈军

操作方法

加入接头实验

材料与仪器

10 mol L ATP PNK (9.3 U ul) 5 x T4 DNA 连接酶缓冲液 LoTE

步骤

1.稀释引物IB和2B, 至质量浓度为350ng/V。

2.加入下列试剂进行引物5’末端磷酸化：

3.在37℃ 下孵育30 min。

4.在65℃ 下放置 10 min热失活PNKo

5.将36ul 的引物IA加入到80ul磷酸化的引物1B中，同样加36ul引物2A到磷酸化的2B(终浓度为217ng/ul)。

6.使引物退火：先加热到95℃，保持 2 min, 随之在65℃ 下放置lOmin，在37℃ 下放置 10 min, 再在室温下放置20 min。

注意：可先取200ng接头进行试连接，然后进行12% 聚丙烯酰胺凝胶电泳。如果磷酸化是成功的，大多数接头（>70%) 应连接成为二聚体（±80bp)。

1.将接头 1 连接到一份结合于 Dynabeads 上的已被 NlaIII 酶解的 cDNA，接头 2 则连接于另一份。在冰上操作加入下述物质：

2.加热到 50C, 保持2 min, 然后在室温下放置15 min，使接头与 MaIII 酶解的 cDNA 退火。

3.加入 2ul T4 DNA 连接酶（5U/ul), 然后在 16°C 连接接头 2 h。

4.在接头连接完成后，用 2004 的 IX 结合及冲洗缓冲液冲洗磁珠 4 次，再用 200ul 的 1X 限制性缓冲液冲洗 2 次。

5.完成最后一步冲洗后，固定磁珠并移去 LoTE。

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