核酸探针分子杂交是指具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下可按碱基互补原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。核酸探针根据核酸的性质，可分为DNA和RNA探针；根据标记物不同，可分为放射性标记探针和非放射性标记探针两大类；根据是否存在互补链，可分为单链和双链探针；根据放射性标记物掺入情况，可分为均匀标记和末端标记探针。

操作方法

探针标记法

原理

分子杂交是核酸链以碱基配对规则的一种结合方式，是核酸的重要理化特性。利用分子杂交这一特性来对特定核酸序列进行检测，必须将杂交链中的一条用某种可以检测的进行标记，这条链就称为核酸探针。因此，核酸探针的制备是分子杂交技术的关键。放射性同位素标记是最早采用的也是目前最常用的核酸探针标记方法。

材料与仪器

DNA
EGFR-PCR产物 washing buffer Detection buffer TE buffe
eppendorf管 Tip头 PCR仪 镊子 无粉手套 量加样器

步骤

1.  灭菌去离子水稀释1 ug DNA至总体积16 ul。
2.  DNA热变性：DNA样品于PCR仪中100℃变性10 min，后迅速置于碎冰中3 min 以上。
3.  加4 ul DIG-Random Labeling Mix，混匀后离心2000 rpm×5 min（4℃）。
4.  PCR仪37℃反应过夜。
5.  加2 ul EDTA终止反应，标记结束。标记物-20℃保存>1年
 

注意事项

1.  用于标记的DNA模板尽可能纯化，以提高标记效率2.  模板DNA>100 bp。

3.  经DIG标记的探针不能用酚/氯仿抽提纯化4.  根据说明书确定标记效率（标记探针及试剂盒阳性对照DIG标记DNA梯度稀释，尼龙膜点样，样本变性，封闭，杂交，现色定量）。

5.  本法亦可用于单链DNA或RNA探针的标记，当标记RNA探针时，需采用逆转录酶，收获产物为标记的单链cDNA。

6.  可根据下表标记产物。

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