质粒克隆操作最费时间的步骤是用电泳的方法对预期大小的外源 DNA 片段和质粒 DNA 片段进行纯化，可以用于将质粒和外源 DNA 的连接在低熔点球脂糖存在的条件下完成。

操作方法

在低熔点琼脂糖中连接质粒和目的DNA实验

原理

质粒克隆操作最费时间的步骤是用电泳的方法对预期大小的外源 DNA 片段和质粒 DNA 片段进行纯化，在以下的方案中（取自Struhl 1985)，质粒和外源 DNA 的连接可在低熔点球脂糖存在的条件下完成。

材料与仪器

限制性内切核酸酶 外源 DNA 片段 质粒 DNA
Tris-Cl MgCl2 DTT ATP T4 噬菌体 DNA 连接酶
低熔点琼脂糖凝胶 恒温板 手提式长波紫外灯 水浴

步骤

一、材料

1. 酶和缓冲液

(1) 2X T4 噬菌体 DNA 连接酶反应混合物：

1 mol/L Tris-Cl ( pH 7.6 ) 1.0 ul，100 mmol/L MgCl₂ 2.0 ul，200 mmol/L DTT 1.0 ul，10 mmol/L ATP 1.0 ul，H₂O 4.5 ul，T4 噬菌体 DNA 连接酶 1.0 Weiss 单位。

每个连接反应需 10 ul 体系。

每次应用前需新鲜配制，装于微量离心管中在冰中预冷，将反应混合物置于冰上备用。

(2) 限制性内切核酸酶

2. 凝胶

低熔点琼脂糖凝胶

3. 核酸和寡核苷酸

外源 DNA 片段，质粒 DNA ( ~100 ug/ml，经去磷酸化处理）

每次连接反应大约需要 100 ng 去磷酸化的 DNA。

4. 专用设备

可设置 70℃ 的恒温板，手提式长波紫外灯（302nm），可设置 16℃ 的水浴。

二、方法

1. 建立一个酶切反应体系（不超过 20 ul），用适当的限制酶消化一定量的靶 DNA，要求最后能获得 250 ng 的目的片段。

2. 用低熔点琼脂糖凝胶电泳分离 DNA 片段。

3. 长波紫外灯下检査凝胶中 DNA 的电泳情况，根据条带的荧光强度估计 DNA 的量，用洁净的手术刀片切下目的条带，尽可能少切琼脂糖（一般约为 40~50 ul）。各目的条带都留下少许在凝胶中不要切，用于照相中表示各条带在凝胶电泳中的位置。

4. 将切下的凝胶片分别装入已做好标记的微量离心管中。

也可以将切下的凝胶片装在密封的微量离心管中于 4℃ 保存几天。

5. 离心管置于 70℃ 恒温块 15 min 以熔化凝胶条，确定离心管中凝胶的体积并计算含有约 200 ng DNA 所需的体积。

这样做的目的是用 10 ul 或更小的体积收取 200 ng 量的 DNA。这要取决于实际情况。对于含量低于 10 的条带（在凝胶中刚好可见)，连接仍可进行，尽管连接效率较低。

6. 预热一个无菌的微量离心管至 37℃ 立即加入下列成分：

去磷酸化质粒 DNA 60 fmol，外源 DNA 片段 120~240 fmol（不超过 10 ul 体积）。

用一个无菌一次性吸头快速混匀上述混合物，避免琼脂糖凝胶凝固。

在连接反应中，外源 DNA 片段与质粒载体的摩尔比一般在 2：1~4：1 之间。

7. 给每一个反应管相应地做两个对照，一个只加去磷酸化质粒载体，另一个只加外源 DNA 片段。

8. 上述的反应管置于 37℃ 温育 5~10 min，而后每管加入现冷的 10 ul 2X T4 噬菌体连接酶反应混合物。用一个无菌一次性吸头快速混匀上述混合物，避免琼脂糖凝胶凝固。16℃  温育 12~16 h。

上述的连接产物可直接用于转化大肠杆菌或电泳。在做转化或电穿孔转化之前，装连接产物的微量离心管需预先于 70℃ 加热 10~15 min 以重新熔解已凝固的凝胶。

习惯上，1~5 ul 连接产物可以用来转化化学方法制备的感受态细胞、而用更为有效的电穿孔转化法则只需 0.1~1.0 ul 的连接产物。采用更大体积进行电穿孔转化会增加溶质的浓度，以至使弧光的发生难以预测。

注意事项

上述的连接产物可直接用于转化大肠杆菌或电泳。在做转化或电穿孔转化之前，装连接产物的微量离心管需预先于 70℃ 加热 10~15 min 以重新熔解已凝固的凝胶。

常见问题

习惯上，1~5 μl 连接产物可以用来转化化学方法制备的感受态细胞、而用更为有效的电穿孔转化法则只需 0.1~1.0 μl 的连接产物。采用更大体积进行电穿孔转化会增加溶质的浓度，以至使弧光的发生难以预测。

本实验来源「分子克隆实验指南第三版」黄培堂等译。

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