流式细胞仪(flow cytometry，FCM)可用于：

（1）免疫学的基础研究和临床应用，尤其是结合单克隆抗体技术；（2）在免疫分型、分选、肿瘤细胞的免疫监测；

（3）机体免疫状态的监测；

（4）免疫细胞的系统发生及特性研究等方面。

操作方法

活细胞免疫荧光技术－流式细胞仪标本的制备

原理

活细胞表面保留有较完整的抗原或受体，先用特异性鼠源性单克隆抗体与细胞表面相应抗原结合，再用荧光标记的第二抗体结合，根据所测定的荧光强度和阳性百分率即可知相应抗原的密度和分布。

材料与仪器

细胞样品
兔血清 第二抗体 单克隆抗体 FCS-RPMI1640 DPBS
玻璃管 塑料管 离心机 荧光显微镜

步骤

制备活性高的细胞悬液（培养细胞系、外周血单个核细胞、胸腺细胞、脾细胞等均可用本法）

1. 用10％ FCSRPMll640 调整细胞浓度为5×10⁶—1×10⁷／ml

2. 取40 μl细胞悬液加入预先有特异McAb（5——50 μl）的小玻璃管或塑料离心管，再加50 μl 1:20（用DPBS稀释）灭活正常兔血清。

3. 4℃静置30 min。

4. 用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2 ml，1000 r／min×5 min。

5. 弃上清，加入50μl工作浓度的羊抗鼠（或兔抗鼠）荧光标记物，充分振摇。

6. 4℃静置30 min。

7. 用洗涤液洗涤2次，每次加液2 ml，1000 r／min×5 min。

8. 加适量固定液（如为FCM制备标本，一般加入1 ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察，视细胞浓度加入100—500 μl固定液）

9. FCM检测或制片后荧光显微镜下观察，（标本在试管中可保存5——7天）

注意事项

1. 整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN3，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。

2. 洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。

3. 加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非特异性染色。

4. 细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。

常见问题

来源《实验动物与动物实验方法学》

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