一、实验原理

         脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革兰阴性菌细胞壁外膜的主要成分之一，可通过与巨噬细胞表面的TLR4受体及其共受体（如CD14、MD-2等）结合，激活NF-κB、MAPK等多条信号通路，诱导细胞产生并分泌TNF-α、IL-6、IL-1β等多种炎症因子。

二、实验材料与试剂

1.细胞

小鼠巨噬细胞系RAW264.7。

2.培养与处理相关试剂

细胞培养基：如高糖DMEM；

胎牛血清（FBS）；

青霉素–链霉素双抗；

胰蛋白酶或无酶细胞消化液（注：RAW264.7通常可通过吹打或细胞刮刀收集，胰酶消化时间不宜过长，以免影响表面受体）；

PBS缓冲液，用于细胞洗涤。

3.建模与检测试剂

LPS（常用大肠杆菌来源LPS，配制成适当浓度的储备液，–20℃分装保存）；

CCK-8试剂，用于检测细胞活力；

ELISA试剂盒：用于检测TNF-α、IL-6等炎症因子；

其他可选指标试剂盒：如NO、PGE₂等（根据实验需求选用）。

4.仪器与耗材

细胞培养箱（37℃，5%CO₂，饱和湿度）；

超净工作台或生物安全柜；

倒置显微镜，用于观察细胞形态与密度；

小型离心机；

酶标仪（可检测450 nm等波长）；

培养瓶、培养皿、96孔板等常规细胞培养耗材；

移液器及配套无菌吸头、离心管、EP管等。

三、实验步骤

1.细胞复苏

从液氮罐中取出RAW264.7细胞冻存管，迅速置于37℃水浴中轻摇，使细胞悬液尽快解冻。解冻后立即将细胞转移至超净工作台中，将悬液倒入离心管中，加入约5 mL含10%FBS的DMEM培养基稀释冻存液，1000 rpm离心约5 min。弃去上清后，用新鲜含10%FBS的DMEM培养基重悬细胞，接种于培养瓶中，置于37℃、5%CO₂的培养箱内培养，使细胞恢复生长。

2.细胞传代

当细胞密度达到约80%–90%时进行传代。弃去旧培养基，用PBS轻柔洗涤细胞1–2次以去除残余血清成分。根据实验室习惯选择适当方式收集细胞：可加入少量胰蛋白酶或无酶细胞解离液，短时间作用，在倒置显微镜下观察细胞变圆、松散后立即加入含10%FBS的培养基终止消化；或采用吹打/刮刀等机械方式使细胞脱落。将细胞吹打成单细胞悬液后，按1∶3或1∶4的比例接种到新的培养瓶，继续于37℃、5%CO₂条件下培养，保持细胞状态良好。

3.细胞铺板

选取处于对数生长期、形态良好的细胞，用适当方式收集并计数。用含10%FBS的DMEM培养基将细胞密度调整至约5×10⁴–1×10⁵个/mL。取96孔板，每孔加入100 μL细胞悬液（约5×10³–1×10⁴个细胞/孔），置于培养箱中孵育过夜，使细胞充分贴壁并恢复状态。

4.LPS诱导炎症模型

细胞贴壁并状态稳定后，弃去旧培养基，更换为无血清或低血清（如1%FBS）培养基，同步化处理约2–4 h。随后设置各组：白/对照组：不加LPS，仅加入等量培养基；LPS处理组：加入不同终浓度的LPS，如0.1 μg/mL、1 μg/mL、10 μg/mL等，每种浓度设置3–5个复孔。加药时可先配制好含不同浓度LPS的培养基工作液，再轻柔加入各孔，避免直接向同一位置滴加高浓度小体积LPS储备液，以减少局部高浓度刺激。处理后将细胞继续置于培养箱中孵育，一般诱导时间可选12–24 h，具体可根据预实验结果确定最佳条件。

5.检测指标

（1）细胞活力检测（CCK-8法）

根据实验设计选定检测时间点（如LPS处理12 h或24 h），向每孔加入约10 μL CCK-8试剂，轻轻混匀后继续在培养箱中孵育1–4 h。孵育结束后，用酶标仪在450 nm处测定各孔吸光度（OD450），扣除空白孔（无细胞，仅含培养基和CCK-8）的背景值后，计算各组细胞活力并与对照组比较。

（2）炎症因子分泌检测（ELISA）

在设定时间点收集各孔培养上清，必要时按ELISA试剂盒说明进行适当稀释。严格按照试剂盒操作步骤进行加样、孵育、洗板、显色和终止反应等操作，在酶标仪相应波长处测定吸光度，并根据标准曲线计算TNF-α、IL-6等炎症因子浓度，从而评估LPS诱导炎症反应的程度。

四、常见问答

Q1：LPS刺激后，细胞大量死亡或脱落，如何处理？

这通常提示LPS浓度过高、作用时间过长，或细胞本身对LPS较为敏感。可以尝试降低LPS浓度、缩短作用时间，或在预实验中筛选更温和但仍能诱导炎症因子升高的条件。同时应检查铺板密度是否过低、培养基是否新鲜、细胞是否已接近衰老，以及是否存在其他应激因素（如pH、渗透压异常等）。

Q2：LPS诱导时必须使用无血清培养基吗？