感染 M13 噬菌体的细菌含病毒双链 RF DNA，培养基中粗提病毒颗粒中含单链子代 DNA，双链 RF DNA 可以采用类似于质粒纯化的方法从感染细胞的小量培养物中分离。从 1~2 ml 的感染细胞培养物中可以分离几微克的 RF DNA，这个量足以进行亚克隆和作限制酶酶切图谱。本实验来源「分子克隆实验指南第三版」黄培堂等译。

操作方法

M13噬菌体双链（复制型）DNA的制备

原理

感染 M13 噬菌体的细菌含病毒双链 RF DNA，培养基中粗提病毒颗粒中含单链子代 DNA，双链 RF DNA 可以采用类似于质粒纯化的方法从感染细胞的小量培养物中分离。从 1~2 ml 的感染细胞培养物中可以分离几微克的 RF DNA，这个量足以进行亚克隆和作限制酶酶切图谱。

材料与仪器

限制性内切核酸酶 大肠杆菌培养物
碱裂解液 乙醇 酚 氯仿 TE
琼脂糖凝胶

步骤

一、材料

1. 缓冲液和溶液

碱裂解液Ⅰ

碱裂解液Ⅱ

碱性裂解液Ⅲ

乙醇

酚：氯仿（1:1，V/V）

含 20 μg/ml Rnase A 的 TE ( pH 8.0)。

2. 酶和缓冲液

限制性内切核酸酶

3. 凝胶

琼脂糖凝胶（0.8%) 悬于 0.5 X TBE，含 0.5 μg/ml 溴化乙锭

4. 载体和菌株

感染了 M13 噬菌体的大肠杆菌培养物

二、方法

感染细胞的裂解

1. 在微量离心机上，将 1 ml M13 感染细胞培养物以最大转速室温离心 5 min，从培养液中分离感染细胞。将上清转移至新的微量离心管，存于 4℃，感染细胞沉淀置于冰上。

2. 细胞沉淀 4℃ 离心 5 s，用自动移液器吸去残余培养液。

3. 加入 100 μl 预冰冷的碱裂解液Ⅰ，剧烈振荡，以悬起细胞沉淀。

4. 在管中加入 200 μl 新配置的碱裂解液Ⅱ。盖紧盖子，快速颠倒混合 5 次。不要振荡。混合后置于冰上 2 min。

5. 在管中加入 150 μl 冰冷的碱裂解液Ⅲ。盖紧盖子，颠倒混合数次，使碱裂解液Ⅲ与黏稠的细菌裂解物混合，置于冰上 3~5 min。

6. 在微量离心机上，将细菌裂解物以最大转速 4℃ 离心 5 min，将上清转移至新的微量离心管。

M13 噬菌体 RF DNA 的纯化

7. 加入等体积酚：氯仿。振荡混合有机相和水相，以最大转速离心 2~5 min 将水相 (上相）转移至新的微量离心管。

8. 加入 2 倍体积的乙醇沉淀双链 DNA。振荡混合，室温放置 2 min。

9. 在微量离心机上，以最大转速 4℃ 离心 5 min 回收 DNA。

10. 轻轻吸去上清，将离心管倒置于吸水纸上，使管内液体流尽，除去吸附于管壁上的任何液滴。

11. 加入 1 ml 70% 乙醇 4℃ 离心 2 min，按步骤 10 的方法去除上清，核酸沉淀室温干燥 10 min。

12. 为了去除微量 RNA，沉淀用含 RNase 的 TE（pH 8.0）重悬，略加振荡。

13. 用适当的限制性内切核酸酶消化并用琼脂糖凝胶电泳分析双链 RF DNA。

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