靶向共价抑制剂（targeted covalent inhibitors，TCIs）先与靶蛋白形成非共价复合物，再与结合口袋附近的特定氨基酸残基形成共价键。其开发重点是在提高靶点占有率和作用持续时间的同时，控制弹头反应性及蛋白质组脱靶风险。

        关键词：靶向共价抑制剂；共价药物；共价弹头；半胱氨酸；可逆共价抑制；不可逆共价抑制；共价动力学；ABPP；化学蛋白质组学；药物设计

1 共价药物与靶向共价抑制剂的基本概念

1.1 共价药物与靶向共价抑制剂

        共价药物是能够与生物大分子形成共价加合物并产生药理作用的化合物总称，靶向共价抑制剂则是其中以抑制特定靶蛋白功能为主要目的的一类。部分化合物自身含有可直接参与共价反应的亲电基团，部分药物则需要经过代谢转化或在特定化学环境中活化后生成反应性中间体。并非所有共价药物都属于典型抑制剂，部分化合物可通过可逆共价结合改变蛋白质构象、配体亲和力或生物物理性质。

1.2 靶向共价抑制剂的结构组成

        靶向共价抑制剂通常由识别骨架、连接区域和共价弹头组成。识别骨架通过氢键、疏水作用、静电作用和形状互补将化合物定位至靶蛋白口袋；连接区域决定共价弹头与目标残基之间的距离、方向和构象自由度；共价弹头负责与半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸或其他可反应残基形成共价键。理想的共价抑制剂在游离状态下反应性有限，只有形成适宜的非共价复合物后，弹头才在局部高有效浓度和正确空间取向下发生反应。

1.3 从经验性共价药物到理性设计

        阿司匹林、青霉素、磷霉素和奥美拉唑等早期共价药物并非按照现代靶向共价药物设计原则获得，其共价作用机制多在药物投入应用后逐步阐明。随着蛋白质结构解析、质谱分析、共价动力学和化学蛋白质组学的发展，共价药物开发逐渐转向基于靶蛋白结构、可反应残基分布和共价弹头性质的理性设计，并扩展至蛋白激酶、蛋白酶、蛋白酶体、代谢酶和小GTP酶等靶点。

2 共价抑制的反应机制与动力学基础

2.1 两步反应机制

        靶向共价抑制通常包括非共价识别和共价成键两个连续步骤：

        E＋I ⇌ E·I → E–I

        其中，E表示靶蛋白，I表示抑制剂，E·I表示非共价复合物，E–I表示共价复合物。第一步决定化合物能否进入靶蛋白口袋并形成正确的结合构象，第二步决定共价修饰的形成速度和稳定性。单纯提高弹头亲电性不能替代高质量的非共价识别，缺乏靶向定位的强反应性化合物更容易造成广泛的非特异蛋白质修饰。

2.2 不可逆与可逆共价抑制

（1）不可逆共价抑制

        不可逆共价抑制剂与靶蛋白形成相对稳定的共价键，在靶蛋白降解或重新合成前，抑制作用通常不会因游离药物浓度下降而迅速消失。丙烯酰胺、氯乙酰胺、环氧化物、环氧酮和部分磺酰氟基团可用于不可逆共价设计，其作用持续时间同时受共价键稳定性、靶蛋白更新速度和细胞补偿机制影响。

（2）可逆共价抑制

        可逆共价抑制剂形成的加合物能够发生逆向解离，常用弹头包括腈基、硼酸、醛、酮及部分活化羰基。该策略可在增强结合强度和延长靶点占有时间的同时，降低永久性非目标蛋白修饰的可能性，但其选择性仍取决于加合物解离速度、组织暴露、代谢稳定性和蛋白质组反应范围。

2.3 共价抑制动力学参数

        不可逆共价抑制剂不宜仅使用单一IC₅₀评价效力。K_I主要反映共价成键前非共价复合物的形成能力，k_inact表示共价失活步骤的最大速率，k_inact/K_I则综合反映抑制剂的靶点识别能力和共价成键效率。由于IC₅₀会随预孵育时间、酶浓度、底物浓度和检测条件变化，不同化合物之间应在统一条件下比较，并结合靶点占有率及洗脱后活性恢复情况进行评价。

表1 非共价抑制剂与靶向共价抑制剂的主要差异

3 可靶向氨基酸残基的选择

图1 靶向共价抑制剂可修饰的代表性氨基酸残基结构

3.1 半胱氨酸、丝氨酸和苏氨酸

（1）半胱氨酸

        半胱氨酸侧链巯基具有较强亲核性，是共价药物设计中应用最广泛的残基。其实际反应性受局部pKa、氢键网络、溶剂可及性、周围电荷和蛋白质构象影响。位于功能口袋附近、能够与弹头形成适宜空间取向且在同源蛋白中保守性较低的半胱氨酸，更适合作为选择性共价位点。

（2）丝氨酸

        丝氨酸侧链羟基的基础亲核性低于半胱氨酸，但位于丝氨酸蛋白酶、青霉素结合蛋白及其他水解酶的催化中心时，可在邻近酸碱残基作用下被活化。β-内酰胺、硼酸、磷酸酯和活化羰基等弹头可用于靶向催化丝氨酸。

（3）苏氨酸

        苏氨酸侧链羟基也可参与共价反应，蛋白酶体催化亚基的N端苏氨酸是具有代表性的共价药物靶点。该残基兼具N端氨基和侧链羟基，可与硼酸、硼酸酯和环氧酮等弹头形成可逆或不可逆共价加合物。

3.2 赖氨酸、酪氨酸及其他可反应残基

（1）赖氨酸和蛋白质N端氨基

        赖氨酸侧链ε-氨基及蛋白质N端α-氨基可与醛、活化酯、磺酰氟和氟硫酸酯等亲电基团反应。赖氨酸通常处于质子化状态，其反应性高度依赖局部疏水环境、邻近残基和氢键网络。蛋白质N端氨基的化学环境与赖氨酸侧链不同，有时可提供更高的位置选择性。

（2）酪氨酸和组氨酸

        酪氨酸的酚羟基可在局部碱性环境中表现出较强亲核性，并与环境敏感型亲电基团发生反应。组氨酸咪唑基兼具亲核反应和金属配位能力，但其共价药物开发成熟度低于半胱氨酸和丝氨酸，通常需要依靠结合口袋的精确定位保证选择性。

（3）天冬氨酸和谷氨酸

        天冬氨酸与谷氨酸侧链羧基可在特定催化环境或经过化学活化后形成共价加合物，但由于羧酸残基在蛋白质中分布广泛且通常带负电荷，其选择性设计难度较高。

（4）甲硫氨酸和N端脯氨酸

        甲硫氨酸侧链硫醚可被特定氧化型试剂或高价碘试剂选择性修饰，目前主要用于化学探针和蛋白质标记研究。脯氨酸侧链本身不含独立亲核基团，但位于蛋白质N端时，其环状仲胺可作为共价反应位点。

表2 可被共价配体靶向的代表性氨基酸残基

4 共价弹头的选择与优化

4.1 共价弹头的选择原则

        共价弹头决定候选化合物能够与何种残基发生反应、共价成键速度、加合物稳定性及反应可逆性。弹头选择应综合考虑目标残基类型、局部微环境、期望作用时间、化学稳定性、代谢途径和蛋白质组选择性。相同弹头连接在不同识别骨架或不同位置时，其实际反应性、靶点占有率和脱靶谱可能存在明显差异，因此弹头不能脱离完整分子单独评价。

4.2 弹头反应性的控制

        弹头反应性过低可能导致细胞内成键速度缓慢和靶点占有率不足，反应性过高则可能与谷胱甘肽、白蛋白及非目标蛋白质广泛反应。结构优化可通过调整吸电子基团、空间位阻、连接长度、构象限制和弹头方向控制成键效率，使共价反应尽可能依赖靶蛋白口袋提供的局部高有效浓度，而不是依赖化合物本身的高基础反应性。

表3 常见共价弹头及其设计特点

5 靶向共价抑制剂的优势与开发限制

5.1 主要优势

（1）提高靶点占有率

        形成共价键后，化合物可在较低游离浓度下维持较高的靶点占有率，适用于需要持续抑制的酶、受体和信号蛋白。

（2）延长作用持续时间

        不可逆共价抑制剂的药理作用可超过其血浆暴露时间，药效恢复更多取决于靶蛋白降解和重新合成，而不是药物从结合口袋中解离。

（3）利用特异残基扩大选择性窗口

        当目标蛋白口袋附近存在同源蛋白中缺失、构象不同或空间位置不同的可反应残基时，可利用共价成键增强目标蛋白选择性。

（4）增强对浅表或瞬时口袋的结合

        共价成键可补偿部分非共价结合能不足，为部分浅表口袋、瞬时口袋和突变特异性口袋提供开发机会，但仍要求靶点具有可识别结构和适宜残基。

5.2 主要限制

（1）非特异共价修饰

        反应性过高或空间定位不足的化合物可能修饰谷胱甘肽、血浆蛋白和非目标蛋白质，增加细胞毒性、器官毒性和药代不确定性。

（2）反应性代谢物

        部分候选化合物在代谢过程中可能生成反应性更强的亲电中间体，并形成与预期靶点无关的蛋白质加合物。

（3）免疫相关风险

        药物与蛋白质形成的共价加合物可能产生新的抗原表位，但实际风险与加合物丰度、组织分布、载体蛋白类型、暴露时间及个体免疫背景有关。

（4）耐药性

        靶残基突变可直接阻止共价成键，结合口袋构象变化、靶蛋白扩增、药物外排、靶蛋白快速更新和旁路信号激活也可能降低药物效应。

6 共价苗头化合物的发现方法

6.1 高通量筛选

        高通量筛选适合从已知共价抑制剂、亲电化合物及含有潜在共价弹头的活性小分子集合中发现候选物。由于共价抑制通常具有明显的时间依赖性，筛选体系应控制预孵育时间、底物浓度、酶浓度和还原剂条件，并避免仅根据单一时间点的IC₅₀判断化合物效力。

6.2 基于片段的药物发现

        基于片段的药物发现（fragment-based drug discovery，FBDD）使用分子量较低、结构较简单的片段覆盖较大的化学空间。共价片段可借助弱非共价识别将弹头定位至特定残基，再通过结构延伸、片段合并和构象限制提高结合能力。TAK-020等BTK共价抑制剂的发现表明，共价片段可作为获得高选择性先导化合物的起点，但片段命中仍需经过修饰位点确认、动力学分析和蛋白质组选择性评价。

6.3 DNA编码化合物库

        DNA编码化合物库（DNA-encoded library，DEL）可在较少实验材料条件下筛选千万至数十亿规模的化学结构。共价DEL需要保证合成反应和弹头结构与DNA标签相容，并通过竞争筛选、突变蛋白筛选、无靶蛋白对照和非反应性类似物区分真正的靶向结合与非特异化学反应。

6.4 基于活性的蛋白质分析

        基于活性的蛋白质分析（activity-based protein profiling，ABPP）利用含反应基团和报告基团的化学探针标记具有特定活性或亲核性的蛋白质。竞争性ABPP可先用候选共价化合物处理细胞、组织或蛋白质组，再加入广谱探针，根据探针标记下降情况识别潜在靶点和脱靶蛋白，因此既可用于未知靶点发现，也可用于评价细胞内靶点占有率和蛋白质组选择性。

7 共价抑制剂的评价方法

7.1 动力学与生化活性评价

        共价抑制剂的生化评价应检测抑制作用是否随预孵育时间延长而增强，并通过多浓度、多时间点数据拟合K_I和k_inact。洗脱、稀释或透析后酶活能否恢复，可辅助区分可逆非共价抑制、可逆共价抑制和不可逆共价抑制。对于底物竞争型共价抑制剂，还应控制底物浓度，避免将底物竞争效应误判为共价成键效率差异。

7.2 质谱与结构分析

        完整蛋白质质谱可检测靶蛋白是否发生预期的质量增加，并判断每个蛋白质分子形成的加合物数量；蛋白质酶解后结合LC-MS/MS可定位具体修饰残基并判断是否存在多位点修饰；X射线晶体学、冷冻电镜和核磁共振可进一步确认识别骨架的结合模式、弹头朝向、目标残基构象及成键几何结构。对于可逆共价加合物，需要优化变性、还原、酶解和色谱条件，避免样品处理过程中发生加合物解离。

7.3 靶点占有率与蛋白质组选择性

        细胞内靶点占有率可通过竞争性探针、点击化学探针、靶向质谱和细胞热迁移分析评价，并应与下游信号抑制和细胞表型结合分析。竞争性ABPP、定量化学蛋白质组学和加合物蛋白质组学可系统识别非目标蛋白；谷胱甘肽反应、血浆稳定性、肝微粒体代谢和反应性代谢物捕获则可用于评价弹头基础反应性及代谢相关风险。

表4 共价抑制剂的主要评价方法

8 代表性共价药物作用机制

8.1 阿司匹林与β-内酰胺类药物

        阿司匹林可乙酰化环氧合酶活性位点的丝氨酸残基；在COX-1中，该修饰阻碍花生四烯酸进入催化通道并持续抑制前列腺素和血栓烷合成，而乙酰化COX-2仍可保留改变后的氧化酶活性并生成15R-HETE等产物。β-内酰胺类抗生素则模拟细菌肽聚糖底物，与青霉素结合蛋白活性位点丝氨酸形成稳定酰化中间体，从而阻断肽聚糖交联和细胞壁合成。

8.2 BTK与EGFR共价抑制剂

        Ibrutinib首先结合BTK的ATP结合口袋，再通过丙烯酰胺弹头与Cys481形成共价键。Afatinib、Dacomitinib、Neratinib和Osimertinib利用ERBB家族激酶ATP结合口袋附近的半胱氨酸实现不可逆抑制。此类化合物的选择性既取决于目标半胱氨酸，也取决于识别骨架对不同激酶构象和突变状态的结合偏好，靶残基突变则可能降低共价成键效率并产生耐药。

8.3 蛋白酶体共价抑制剂

        蛋白酶体催化亚基以N端苏氨酸作为亲核残基。Bortezomib的硼酸基可与该苏氨酸形成可逆共价四面体加合物，Carfilzomib的环氧酮则与N端苏氨酸形成更稳定的不可逆加合物。两类化合物表明，针对同一靶残基可通过不同弹头调节共价反应速度、稳定性和可逆性。

8.4 KRAS G12C共价抑制剂

        KRAS G12C突变在第12位引入半胱氨酸，为突变选择性共价药物设计提供了特异位点。Sotorasib和Adagrasib结合KRAS G12C的开关Ⅱ口袋，并与Cys12形成不可逆共价键，使KRAS偏向非活化状态。KRAS再激活、上游受体信号增强、旁路通路激活和继发突变仍可能降低此类药物的持续作用。

8.5 病毒蛋白酶可逆共价抑制剂

        Boceprevir通过酮酰胺弹头与HCV NS3/4A蛋白酶的催化丝氨酸形成可逆共价加合物，Nirmatrelvir则利用腈基与冠状病毒主蛋白酶Mpro的Cys145形成可逆共价加合物。此类设计利用蛋白酶催化残基的高亲核性，在增强结合强度的同时保留一定解离能力。

9 共价药物与共价抑制剂研究相关产品

参考文献

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[1] 小分子抑制剂选择指南