细胞自噬过程的观察和检测可应用于：

（1）研究细胞防御和应激调控机制；（2）自噬体膜的来源问题研究。（3）细胞器自噬研究。

操作方法

工具药、融合蛋白等示踪自噬形成

原理

正常培养的细胞自噬活性很低，不适于观察，因此，必须对自噬进行人工干预和调节，包括自噬诱导剂、自噬抑制剂等工具药，以及反义RNA干扰技术（Knockdown）、突变株筛选、外源基因导入等。并通过荧光显微镜或者Western Blot等技术来检测。

材料与仪器

细胞
自噬诱导剂 自噬抑制剂 单丹磺酰尸胺（MDC） 0.1%SDS
荧光显微镜 细胞爬片

步骤

一、正常培养的细胞自噬活性很低，不适于观察，因此，必须对自噬进行人工干预和调节

二、细胞经诱导或抑制后，需对自噬过程进行观察和检测，常用的策略和技术有：

1、观察自噬体的形成；

2、在荧光显微镜下采用GFP-LC3融合蛋白来示踪自噬形成；

3、利用Western Blot检测LC3-II/I比值的变化以评价自噬形成；

4、检测长寿蛋白的批量降解；

5、MDC（Monodansylcadaverine，单丹磺酰尸胺）染色；

6、CellTrackerTM Green染色：主要用于双染色，但其能染所有的液泡，故也属于非特异性的；

注意事项

一、自噬诱导剂1.Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模拟内质网应激2.Carbamazepine/ L-690，330/ Lithium Chloride（氯化锂）：IMPase 抑制剂（即Inositol monophosphatase，肌醇单磷酸酶）3.Earle's平衡盐溶液：制造饥饿4.N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3K Pathway抑制剂5.Rapamycin：mTOR抑制剂6.Xestospongin B/C：IP3R阻滞剂二、自噬抑制剂1.3-Methyladenine（3-MA）：（Class III PI3K） hVps34 抑制剂2.Bafilomycin A1：质子泵抑制剂3.Hydroxychloroquine（羟氯喹）：Lysosomal lumen alkalizer（溶酶体腔碱化剂）除了选用上述工具药外，一般还需结合遗传学技术对自噬相关基因进行干预：包括反义RNA干扰技术（Knockdown）、突变株筛选、外源基因导入等。

常见问题

在研究自噬相关蛋白时，需对其进行定位。由于自噬体与溶酶体、线粒体、内质网、高尔基体关系密切，为了区别，常用到一些示踪蛋白在荧光显微镜下来共定位：

Lamp-2：溶酶体膜蛋白，可用于监测自噬体与溶酶体融合。

LysoTrackerTM 探针：有红或蓝色可选，显示所有酸性液泡。

pDsRed2-mito：载体，转染后表达一个融合蛋白（红色荧光蛋白+线粒体基质定位信号），可用来检测线粒体被自噬掉的程度（Mitophagy）。

MitoTraker探针：特异性显示活的线粒体，荧光在经过固定后还能保留。

Hsp60：定位与线粒体基质，细胞死亡时不会被释放。

Calreticulin（钙网织蛋白）：内质网腔

（注意：这些蛋白均为胞浆蛋白，爬片或胰酶消化的细胞在做免疫荧光前需先透膜（permeablize），可采用0.1%SDS处理。）

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