单克隆抗体鉴定实验鉴定指标有些与多克隆抗体的相同, 所采用方法可通用; 但有些指标的鉴定则具有 McAb 的特殊性. 目前, 单克隆抗体鉴定实验主要有 7 种: 抗体效价鉴定实验、抗体特异性鉴定、McAb 的 Ig 类、亚类及型的鉴定实验、杂交瘤细胞的染色体分析、McAb 中和活性的鉴定实验、McAb 识别抗原表位的鉴定实验和 McAb 亲和力的鉴定实验.

原理

单克隆抗体鉴定实验的基本原理是在细胞融合成功、经克隆化筛选出可分泌特异性 McAb 的杂交瘤细胞、并稳定建系后, 需制备一定量 McAb 对其特性进行系统鉴定, 以便更好地应用.

操作方法

杂交瘤细胞的染色体分析实验

原理

杂交瘤细胞的染色体分析实验的基本原理是当细胞分裂处于中期时，染色体长短和大小恰到好处，是分析染色体的最好阶段。因此，要显示染色体，首先就要获得尽可能多的中期分裂象；其次，杂交瘤细胞的染色体多，密集在细胞中，必须把它们分散开才能看清楚。

材料与仪器

器材：离心管、离心机、恒温水浴锅、超净台、显微镜。
试剂：
① 20％FCS－RPMI 1640 培养液。
② 秋水仙素溶液：称取 10 mg 秋水仙素，溶于 100 ml 生理盐水中（即为 100 μg/ml），过滤除菌后分装，－20℃ 冻存备用。
③ 低渗液：0.075mol/L 的 KCl 溶液。
④ 固定液：取甲醇 3 份，冰醋酸 1 份，混匀即成（临用前新鲜配制）。
⑤ Giemsa 染液原液：称取 Giemsa 粉末 0.5 g，溶于 33 ml 甘油中（可先在研钵内加入少量甘油与 Giemsa 粉混合，研磨直至无颗粒为止，再将剩余甘油倒入），55-60℃ 保温 2 小时后，加入 33 ml 甲醇混匀，保存于棕色瓶内备用。
⑥ Giemsa 工作液：取 Giemsa 染液原液 1 份，加 0.15mol/L、pH6.8 的磷酸缓冲液 9 份，混匀即成（临用前新鲜配制）。

步骤

杂交瘤细胞的染色体分析实验的基本过程可分为如下几步：
（1）培养细胞
A 在加秋水仙素前 36 - 48 小时将杂交瘤细胞传代（实验时杂交瘤细胞可生长至对数期）。
（2）秋水仙素处理
A 终止培养前 4 - 6 小时，在培养的杂交瘤细胞中加入秋水仙素，使最终浓度为 0.1 - 0.4 μg/ml；如使用秋水仙胺则最终浓度为 0.02 - 0.05 μg/ml。B 培养结束后，收集细胞于离心管中，以上步骤均需无菌操作。
（3）染色体制备
A 离心：1000 r/min 离心 10 分钟，弃去上清液。B 低渗处理：加入预热到 37℃ 的 0.075 mol/L KC1 低渗液 5 ml，轻轻悬浮细胞沉淀并混匀，置 37℃ 恒温水浴 15-20 分钟。C 预固定：向悬液中加入新配制的固定液 1 ml，混匀（使细胞表面先轻微固定，能防止固定后细胞粘连成团块），1000 r/min 离心 10 分钟，弃去上清液。D 固定：加入固定液 5 ml，重悬细胞沉淀并混匀，室温静置 20-30 分钟，1000 r/min 离心 10 分钟，弃去上清液。E 再固定：操作同上。F 制悬液：视细胞数量多少加入 0.3-0.5 ml 固定液，制成细胞悬液。G 滴片：用滴管吸取细胞悬液 1-2 滴，滴在刚从冰水中取出的载玻片上，立即吹散，并在酒精灯火焰上通过数次，使细胞平铺于载玻片上，空气中自然干燥。
（4）染色
A 用新配制的 Giemsa 工作液染色 10 - 20 分钟，然后用自来水洗去染液，空气中自然干燥。
（5）镜下观察
A 低倍镜下寻找分散良好、染色适中的分裂象，油镜下观察染色体形态并计数。每份标本应计数 100 个完整的中期核细胞，记录染色体数目后列成表格，分析染色体数目的分布，并注意观察是否有标志染色体。

注意事项

1. 秋水仙素处理时间过长，分裂细胞多，染色体短小；反之，则分裂细胞少而染色体细长，都不宜观察形态及计数，故秋水仙素的浓度及作用时间要准确掌握。

2. 低渗液浓度及处理时间要适当，且低渗处理后混匀细胞一定要轻柔，否则易引起细胞膜破裂、染色体散失。

3. 固定液应在使用前临时配制，否则有机溶剂挥发，将无法有效固定细胞。

4. 载玻片一定要彻底洗净，勿留任何油脂，否则染色体分散不好。

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