MTT 法对细胞生长状况的检测实验是通过 MTT（化学名称为 3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴盐，商品名为噻唑蓝）对细胞生长检测的常用方法。该法以其灵敏性高、重复性好、操作简便、经济安全，而得到广泛应用。

原理

MTT 法对细胞生长状况的检测实验的基本原理是利用 MTT 的可接受氢原子而发生显色反应的特点。活细胞中的线粒体具有琥珀酸脱氢酶，能够使外源性的 MTT 还原为难溶性的蓝紫色结晶物，而死细胞缺乏线粒体活性，因此无此活性。

蓝紫色结晶物可以溶解在二甲基亚砜中，应用酶标仪在 490 nm 波长可以检测其光吸收值，并根据吸收值的高低判断细胞数量。在一定数量的细胞范围内，吸收值与细胞数目成正比。近年的研究证明蓝紫色结晶物最佳吸收光波为 570 nm。

操作方法

MTT法检测细胞毒性与增殖实验

原理

活细胞中的线粒体中的一些脱氢酶，能够使外源性的 MTT 还原为难溶性的蓝紫色结晶物，而死细胞无此活性。蓝紫色结晶物可以溶解在二甲基亚砜（DMSO）中，用酶标仪测定 490 nm 波长的吸光度（OD 值）即可定量检测细胞的毒性与增殖情况。细胞增殖与吸光度成正比，细胞毒性与吸光度成反比。若用成熟的试剂盒检测，则测定 570 nm 的吸光值。

材料与仪器

细胞、 96 孔培养板、移液枪、枪头、15 ml 离心管、PBS、胰蛋白酶、细胞培养基、酶标仪、二甲基亚砜、 MTT

步骤

1、根据说明书配制 MTT 溶液，用 PBS 配制终浓度为 5 mg/ml，配制后可适当分装放 -20 ℃ 避光保存。

2、适当浓度的细胞接种到 96 孔板后按正常实验需求处理。

3、培养结束后，每孔加入 10 μl MTT 溶液， 37 ℃ 继续孵育 4 h。

4、小心吸去孔内的上清液（对悬浮细胞要求离心，离心后弃上清液），加入 150 μl DMSO，摇床上低速振荡 10 min，使紫色结晶溶解。在酶联免疫检测仪上，490 nm 波长下测定各孔光吸收值（OD 值），记录结果。

5、除了 DMSO，还可选择成熟的 MTT 试剂盒检测，则每孔加入 100 μl 结晶溶解液，在细胞培养箱中继续孵育 3~4 小时，至结晶全部融解。测定 570 nm 处的吸光值。

注意事项

1. 酶联免疫检测仪测试的 OD 值仅在适当的细胞浓度时与细胞数目呈线性关系。因此，在实验时，必须选择适当的细胞接种浓度，一般 96 孔板每孔 1 000~5 000 个细胞左右，注意接种到培养板后要混匀，防止细胞成团分布不均。

2. 血清物质会干扰 OD 值，因此，在显色后尽可能将孔内残余培养基吸净。

3. 设空白对照。与试验孔平行设定不加细胞仅加培养基的空白对照孔，其他实验步骤保持一致。比色时，以空白孔调零。

4. 96 孔板进行实验时，若培养时间较长需注意蒸发问题。可采取弃用周围一圈，改用 PBS 或培养基替代。

5. MTT 最好现用现配，避免反复冻融。低温下容易凝固，需融解后再使用。

6. 测定 OD 值前，需注意细胞孔板中无气泡。

7. 加入 MTT 生成结晶后，去除上清液需小心不要把结晶去掉。

8. 结晶一定要完全融解后再测定 OD 值。

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