N1色谱柱的规格

应用：通过HPLC分析和纯化荧光团和紫外发色团标记的聚糖。

描述：N2 HPLC柱含有聚合物酰胺涂层的颗粒，该涂层优化了复杂聚糖混合物的高分辨率色谱。

颗粒：5μm粒径，80埃孔径，聚合物酰胺涂层。

色谱柱尺寸               型号 #                                    尺寸

                              N498827                               4.6 x 250mm

                              N498833                               4.6 x 10 mm

流速：柱的典型流速=0.4-1.0 ml/min                 最大流速=1.2 ml/min

色谱柱的最大压力=2250 psi（150 kg/cm2）   

pH范围：2.0-7.5

温度：典型工作温度=30℃，最大温度范围=10-80℃。

溶剂：聚糖分析的典型溶剂系统包括乙腈梯度和pH 4.4 含甲酸铵的水缓冲液，推荐的缓冲液为pH 4.4，50 mM甲酸铵，其以50ml等分试样提供，用于补充2升。（缓冲液：N-BUFFX40）

运输溶剂：75%乙腈-25%水

清洁溶剂

1.水[从键合相中去除极性溶质]

2.45%乙腈（aq）[脱附疏水化合物]

3.0.1%三乙胺在80%乙腈中[以除去解吸的碱性化合物]

4.50mM甲酸铵pH 4.4/乙腈（1:1 v/v）[以去除离子化合物]

储存：长期储存前，用至少5倍柱体积的75%乙腈（aq）冲洗色谱柱。

柱保护：将所有溶剂过滤至0.2μm，并使用氦气喷射或真空脱气进行脱气。

在加载到柱上之前，使用0.2μm滤膜过滤所有样品。

在样本注射器和柱之间安装一个直列式过滤器。

请致电我们，咨询最适合使用的样品和在线过滤器。

样本量：可装载在柱上的聚糖样本的最大数量取决于聚糖组分的数量和类型以及任何非聚糖材料的性质。成功分析的典型范围是每个样品峰1 nmol-1 nmol，总聚糖高达200 nmol。

合适的样品：合适的样品包括用以下标签标记的聚糖：2-AA（2-氨基苯甲酸）、2-AB（2-氨基苄酰胺）、AMAC（2-氨基吖啶酮）、2-AP（2-氨基吡啶）、AMC（7-氨基-4-甲基香豆素）、ABEE（4-氨基苯甲酸乙酯）。

样品：将样品过滤至0.2μm，然后使用离心蒸发器干燥。

制备：重新溶解在5-50μl的起始缓冲液（即HPLC梯度开始时使用的溶剂混合物）中，然后注入。

如果可能，在溶解后立即注入样品，以尽量减少在高有机溶剂条件下样品沉淀的问题。

样品检测：荧光或紫外吸收取决于染料的使用

处理：确保使用的玻璃、塑料制品或溶剂不含糖苷酶和环境碳水化合物。在所有样品处理程序中使用无粉末手套，避免污染环境碳水化合物。

安全：请阅读所有使用化学品的材料安全数据表（MSDS）。

所有涉及标记试剂的过程都应使用适当的个人安全防护措施-眼镜、耐化学手套（如丁腈橡胶）等-并在适当的情况下在实验室通风柜中进行。

仅供研究使用。不用于人类或药物

HPLC系统要求

N1柱可与能够以0.3至1.0ml/min的流速递送准确梯度的HPLC系统一起使用。通常，在高压下（在泵头之后）混合洗脱液的系统具有较低的死体积，并提供更准确的梯度，该梯度适合于柱所需的流速。

对于4.6mm柱，将样品注入高达100μl的起始缓冲液（即HPLC梯度开始时使用的溶剂混合物）中。

荧光检测器需要具有以下检测波长：

为了实现最佳检测，请使用宽狭缝宽度（例如10–20 nm）。亚微微摩尔水平的2-AB或2-AA标记的聚糖可以以良好的信噪比检测（取决于所用检测器的灵敏度）。

为了提高聚糖分析的重复性和中间精度，使用柱温度控制器。柱温35℃时，可获得良好的结果。

色谱柱的安装

在立柱安装过程中，我们建议：

•应使用不锈钢或PEEK（聚醚醚酮）材质的标准1/16“OD管和10-32（1/16”）接头将N1柱连接到HPLC系统。建议使用手指密封PEEK接头和卡套管（0.17 mm/0.007“ID），以便于连接并尽量减少对柱螺纹的损坏。流向由列标签上的箭头指示。

•保持注射器到柱和柱到检测器之间的管道长度尽可能短，以尽量减少分散效应。

•在注射器和N1柱的头部之间安装一个0.2μm的直列式过滤器，以防止颗粒对柱造成损坏。

•在分析任何样本之前，按照以下步骤调整新安装的柱。

新安装柱的预处理

准备新安装的聚糖分析柱，如下所示：

•通过运行两个完整的N1-01梯度（见下文）对柱进行预处理，无需注入任何样品。

•通过使用N1-01梯度运行荧光标记的葡萄糖均聚物（GHP）作为系统适用性标准，检查色谱柱性能。

柱清洁和储存

大量使用后，N1柱可能被强吸附的样品成分污染，从而导致柱性能下降。

光污染

1 按照上述“色谱柱预处理”部分中的方案清洁色谱柱。

2 在N1-01的启动缓冲区中平衡。

3 在不注射样本的情况下进行空白运行，以检查基线。

清洁介质污染

1 穿过一个N1-01坡度。

2 用50%（v/v）50 mM甲酸铵pH 4.4 cat洗涤。N-BUFFX40，50%（v/v）乙腈，0.1 ml/min过夜

3 穿过一个N1-01坡度

4 运行系统适用性检查

清洁重度污染

用以下物质清洗色谱柱：

1 水[4小时或更长，以0.1 ml/min]-从键合相中去除极性溶质

2  45%乙腈（aq）[4小时或更长，以0.1 ml/min]-解吸疏水化合物

3  0.1%三乙胺在80%乙腈中[4小时或更长时间，0.1 ml/min]-以除去解吸的碱性化合物

4  50 mM甲酸铵pH 4.4/乙腈（1:1 v/v）[4小时或更长，以0.1 ml/min]-去除离子化合物

5  穿过一个N1-01坡度。

6  运行系统适用性检查

长期储存

对于长期储存，应使用从操作缓冲液到100%水，然后到大于50%乙腈水溶液（v/v）的储存溶剂的梯度洗涤柱。

样品制备

N1柱应用于分析纯化的聚糖（荧光标记或未标记）。样品必须无微粒。在加入乙腈之前，应将样品溶解在水中，使其组成与梯度开始时相同（例如，将样品溶解于35μl水中，然后在注射前加入65μl乙腈，使用N-聚糖分析梯度法：N1-01）

荧光标记

荧光聚糖可通过使用带有标签的还原胺化法衍生纯聚糖并在药筒上纯化来制备。

过滤样本

通过带有0.2μm孔径膜的旋转过滤器或注射器过滤器过滤，去除样品中的颗粒。

唾液酸化甘氨酸

如果暴露于酸性条件和升高的温度，唾液酸化聚糖可能会脱分析。通过以下方式避免对此类样品进行脱分析：

a、 尽量减少接触酸（如果可能，保持pH值在5-8之间），以及

b、 尽量减少暴露于25℃以上的温度。

N1酰胺HPLC柱分析甘氨酸

溶剂

本指南中的聚糖分析梯度基于以下溶剂：

溶剂A：乙腈

溶剂B：50 mM甲酸铵pH 4.4 （N-BUFFX40）

梯度N1-01：通用寡糖分析梯度

用作2-AB和2-AA标记寡糖分析的通用梯度。

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