利用高压注射技术转运裸 DNA 实验
利用高压注射技术转运裸 DNA 实验
在对动物细胞进行核酸转运和基因表达时常用的各种病毒或非病毒手段中，裸质粒D N A 技术具有许多优点。首先，质粒 D N A 可通过D N A 重组技术直接进行操作，对技术与设备无特殊要求！其次，此法即使用于大规模生产成本也不高；第三，由于质粒D N A 无免疫原性，所以可多次给药也不会诱导抗体产生（Jia〇et al.1992)。与人们通常认识相悖的是，即使外源基因没有整合于染色体，通过裸质粒D N A 技术仍可能使之在分裂或缓fe分裂细胞中得到长期表达。尽管一直以来以非病毒途径转移核酸被认为是低效的，但通过血管内转运的裸D N A 表达水平已接近以病毒为载体达到的水平。作者：T.弗里德曼等,译者：殷勤伟等，本实验来自「基因转移」
操作方法
通过尾静脉局压注射将质粒DNA输入小鼠肝脏 步骤 通过尾静脉局压注射将质粒 DNA 输入小鼠肝脏 材料 试剂 用 去 离 子 水 配 制 I O X 储 存 液 ： 〇. 8 5 % N a C l 、 0 . 0 3 % K C 1 < ! > 、 0 . 0 3 % C a C l 2 < ! > ， 过 滤 小鼠 主 要 用 IC R 或 C57BL/ 6 小鼠为实验动物。其他品系如 BABL/c, ddY 及转基因小鼠也可。 质粒 D N A 为保证最好的结果，质 粒 D N A 需去内毒素。 QIAGEN 等公司提供相应试剂盒提取去内毒素的质粒 DNA。含内毒素的质粒样本需用购买的去内毒素试剂盒处理。在提取质粒的最后步骤中避免使用含 T ris 的缓冲液，因为这些缓冲液有毒性。应正确选择质粒上的增强子、启动子等转录调控原件，因它们可影响转基因的表达数 f l 及持续时间。如含病毒启动子的质 粒（如巨细胞病毒早期增强子/启动子）可在转染肝脏初期高表达，但 24 h 内表达即可终止 。已 有 研 究 报 道 了 含 肝 细 胞 内 长 期 表 达 原 件 的 质 粒（ M iaoet al.2000; W ooddelletal.2005)。 仪器 锥 形 管（塑料， 50 ml; 见步骤 1) 一次性注射器（3 ml) 加热灯 注 射 针 头（2 7 号） 方法 1.将小鼠头朝里装于 50m l 锥形管中，管底有 3〜5 mm 呼吸孔，管盖上有裂口以使尾巴穿出。 也可用购买的小鼠或大鼠专用固定管。 2•注射前用热灯照射小鼠 IOmin 以扩张尾部血管。注意热灯位置，勿太近使小鼠过热。因尾静脉可见，所以保证了理想的注射效果黑色小鼠尾静脉较难看见。可在尾部涂抹70% 异丙醇以增加血管和皮肤的反差。 3.将质粒 D N A (通常 5〜100M g ，去内毒素）加人室温的无菌 I X R i n g e r 溶液。注射液总量大概为小鼠体重的 10% (如 20 g 鼠注射 2m l )。 注射量不足将造成质粒转人效果不佳。因会引起注射后综合征，不能用盐溶液作为注射液。注射量一定时可按比例增加或减少其中核酸的量。 4•将 0.5i n 长 的 27 号针头装于 3m l 注射器，进针于扩张的尾静脉，最好位于尾部中间或靠近远端。 注射时最好将针头全部插人血管以避免渗漏。 5.先缓慢推人少量注射液以确保针头已打人血管。确保进针正确后， 5〜7s 内将所有液体注入尾静脉。是否能将注射液尽快匀速的推人动物血管对获得最大输人效率的有重要影响。注射完毕后动物可出现短时静止和呼吸困难，但一般不超过 15〜20 min。 试剂 异氟烷 大鼠 热 水（见步骤 4) 仪器 蝶形输液器（21 号 X 3/4i n 注射针头） 一次性注射器（60m l ) 解剖显微镜 Harvard Apparatus P H D 2000 注射泵 Surgvet/Anesco Isotec 4 流量计 方法 1.将质粒 D N A (50〜500 ug，去内毒素）溶 于 1 0 % 大鼠体重的无菌、室 温 I X R i n g e r溶 液（如 120 g 大鼠注射 12m l 液体)。 2.60m l 注射器吸取注射液，并连于蝶形输液器（2 1 号翼状输液针头）。 3.设 置 Surgvet/Anesco Isotec 4 流量计，用 1 % 〜2 % 异 氟 烷（〇.4L /m i n ) 麻醉动物。 4•将鼠尾浸人热水中以扩张血管。 5.在解剖显微镜下，将输液器尾端 21 号翼状输液针头斜角进针。将注射器置于设置好的 Surgvet/A n e s c o Isotec 4 流量计。 6.先注入少量注射液以确保针头已打人血管。确保进针正确后，以注射泵最大注射速度（l O O m l/m i n ) 注入注射液。 如注射泵不能用，也可用手动注射，但其效果可能受影响。 试剂 异氟烷 生理盐水 0 . 9 % NaCl，用去离子水配制。滤过除菌，室温保存。 酮洛芬或醋氨酚 (见步骤 9) 小鼠 主要用 I C R 或 C 57B L/6 小鼠为实验动物。其他品系如 B A B L /c、 d d Y 及转基因小鼠也可。 质粒 D N A 同尾静脉高压注射所用质粒 D N A 准 备 方 法（方 案 1)。与肝脏不同，在肌肉长期表达的质粒可含有病毒或重组外源性增强子/启动子。注 人 后 4〜7d 方可获得肌肉内最大表达效果。 仪器 一次性注射器（I O m l) 解剖显微镜料（可选） 镊子 凝胶发泡剂 H a rvard Apparatus P H D 2000 注射泵 医用胶布 持针钳 剌刀 小牵引器 Surgvet/Anesco Isotec 4 流量计 外科线 注 射 器（3 0 号） 用 Drummel 工具磨光针头缩小外径。 止血带、止血钳 制作大鼠或小鼠止血带简单而有效的方法：剪下乳胶手套一指尖，再 将 其 末 端 剪 下 1c m 即可（见 步 骤 2)。 方法 1.设 置 Surgvet/Anesco Isotec 4 流量计，用 1 % —— 2 % 异 氟 焼（0.4L/min) 麻醉动物至手术所需深度。 2•将待注射的动物下肢去毛，并用止血带扎住以阻止进出血流。将腿部穿人止血带直至近端被紧紧包住（只需部分套住腿四头肌近端）。拧紧止血带并用止血钳夹稳固定 。用医用胶带将动物四肢固定于手术操作台，使动物保持仰卧位。核酸输送或到达区域与止血带的位置有一定关系。 3 . 在腿部中央靠近踝处作一中线小切口，暴露大隐静脉。 4•用 1.0 m l 室温、无菌的生理盐水溶解质粒 D N A (通常 5〜300ug g ，去内毒素）。 此注射剂量对于 2 5 g 动物最佳，但动物不同体重对于剂量影响不大。 5•用 3m l 注射器吸取注射液，并连上 P E -I O 导管。将 注 射 针 头（30 号）装上导管，用持针钳夹住插人大隐静脉。 解剖显微镜可使进针更为容易。注射时可用棉签轻压以保持针头的位置。注射过程中必须注意腿的活动，否则易穿破血管。 6.设置 Harvard Apparatus P H D 2000 注射泵，使注射液以 8m l/m i n 的速度注射完毕。保留止血带直至注射完后 2m i n ，之后移除导管和止血带。通过凝胶发泡剂和轻压止血。 7•用 4-0 号线缝合伤口。 8 .密切观察动物直至麻醉清醒，用热灯可防止动物体热丢失有利于恢复。 9.术 后 2d 每日皮下注射酮洛芬（5m g /k g )。 也 可 用 醋 氨 酚 [lOOmg/ (k g . d) , 饮 水 口 服 ] 代 替 酮 洛 芬 。 仪器 蝶 形 输 液 器（2 5 号 X 3/4i n 注 射 针 头 ) 一次性注射器（IOml) 方法 2.I O m l 注射器吸取注射液，并连于蝶形输液器 （25 号翼状输液针头）。 3 . 在大隐静脉侧下方斜刺进针。 4•设置 Harvard Apparatus P H D 2 0 0 0 注射泵，使注射液以 lOnu/m i n 的速度注射完毕。 如需了解更多产品详情，请前往阿拉丁官网查询。
Ringer 溶液
除 菌 ； 用 无 菌 去 离 子 水 稀 释 为 工 作 液 后 室 温 保 存 。
如大鼠体重超过 200 g , 则适当减少注射量，总量不超过 18 ml。
可使静脉易见，有利于进针。
1 . 将质粒 D N A (50〜750 ug，去内毒素）溶于〇. 〇 3 倍大鼠体重的无菌、室温生理盐水(如 120 g 大鼠注射 3. 6m l 液体)。
危险品化学品经营许可证（带存储）