所需材料

溶液配方

10 ×TBS

• 0.1 M Tris-HCl （pH 7.5）（例如，T301492）
• 1.5 M 氯化钠 
• 30 mM CaCl2 
• 20 mM MgCl2 
• 50 mM丁酸钠（pH 8.0）  

消化缓冲液

• 0.32 M蔗糖（例如，S112226）
• 50 mM Tris-HCl （pH 7.5）（例如，T301492） 
• 4 mM MgCl2
• 1 mM CaCl2 
• 0.1 mM PMSF（例如，P301906） 
• 5 mM 丁酸钠  

裂解缓冲液

• 1.0 mM Tris-HCl （pH 7.4）
• 0.2 mM Na2EDTA（例如，E116435） 
• 0.2 mM PMSF（例如，P301906） 
• 5 mM 丁酸钠  

孵育缓冲液

• 50 mM氯化钠
• 20 mM Tris-HCl （pH 7.5）（例如，T301492） 
• 20 mM 丁酸钠 
• 5 mM Na2EDTA（例如，E116435） 
• 0.1 mM PMSF（例如，P301906）  

缓冲液A

• 50 mM Tris-HCl（pH 7.5）（例如，T301492）
• 10 mM EDTA（例如，E196386） 
• 5 mM 丁酸钠 
• 50 mM氯化钠  

缓冲液B

• 50 mM Tris-HCl （pH 7.5）（例如，T301492）
• 10 mM EDTA（例如，E196386） 
• 5 mM 丁酸钠 
• 100 mM氯化钠

缓冲液C

• 50 mM Tris-HCl （pH 7.5）（例如，T301492）
• 10 mM EDTA（例如，E196386） 
• 5 mM 丁酸钠 
• 150 mM氯化钠  

蛋白A琼脂糖凝胶

• 4°C 在缓冲液A中预溶胀蛋白A琼脂糖凝胶过夜。
• 离心（10,000 xg，10 分钟），并在大约等体积 (50% v/v) 的缓冲液 A 中重悬沉淀。

第 1 阶段  从培养的人类细胞中制备天然染色质

此阶段使用的所有溶液都需要冷藏。

含有蔗糖的溶液必须在使用当天新鲜配制，并且应在使用前将蛋白酶抑制剂添加到所有裂解溶液中（0.1mM PMSAF 和全部微型蛋白酶抑制剂；市售）。

步骤

1. 将细胞（如HL-60或淋巴母细胞）培养至约1 × 106个细胞/ml的密度，直到它们进入对数生长期。

2. 收获细胞：离心样品（1,000 g，10分钟，4°C）并用冰冷的 PBS洗涤细胞沉淀3次。

注意： 当使用乙酰化组蛋白抗体时，整个染色质分离过程中，所有溶液中必须添加5 mM 丁酸钠，来防止脱乙酰化。

3. 将细胞沉淀以 2×107 个细胞/ml重悬于TBS中，并在TBS中添加等体积的 1.0% v/v Tween 40。

3.1. 添加PMSF至终浓度为 0.5 mM。

3.2. 在冰上轻轻搅拌1小时：

• 将悬浮液转移到带有小磁棒的50 ml试管中。
• 将试管置于冰上，再放到磁力搅拌器上搅拌。

4. 将细胞裂解物转移至全玻璃均质器中，并使用“A”字形或普通研棒将7 ml试样均匀搅拌七轮，等分为七份。

• 通过相差显微镜检查细胞核是否已释放；完整的细胞应该有一个被光环包围的细胞核中央暗区，这是密度较低的细胞质。

警告： 在各轮均质化过程中，细胞始终放置在冰上。

提示： 您可能需要增加或减少此均质化步骤，以最大限度地提高细胞核产量，具体取决于细胞系。

5. 离心样品（8,000 g，20分钟，4°C）。

6. 将细胞核沉淀重悬于25% [w/v] 蔗糖/TBS 中，浓度为 4 × 106个细胞核/ml。

6.1. 底层铺有0.5体积的50% [w/v] 蔗糖/TBS。

6.2. 离心样品（10,000 g，15分钟，4°C）。

警告：含有蔗糖的溶液必须当天新鲜配制。

7. 弃去上清液并用 5 ml 25% [w/v] 蔗糖/TBS 洗涤细胞核沉淀。

7.1. 离心样品（10,000 xg，15分钟，4°C）。

警告： 含有蔗糖的溶液必须当天新鲜配制。

8. 将细胞核沉淀重悬于5 ml 消化缓冲液中，检查细胞核悬浮液稀释样品在 260 nm和280 nm处的吸光度比。

8.1. 根据 A260 读数计算大致 DNA 浓度（A260/A280 的比率应约为 1.1）。

8.2. 染色质产量（以µg为单位）的计算公式为：A260 ×稀释倍数×体积×50。

8.3. 离心样品（10,000 rpm，10分钟，4°C），并将细胞核沉淀以 0.5 mg/ml 重悬于1.7 ml Eppendorf 管中。

8.4. 如有必要，分成 1 ml 等份。

警告：含有蔗糖的溶液必须当天新鲜配制。

第2阶段  微球菌核酸酶消化

我们通常在1.0 ml反应体积中每 0.5 mg DNA 添加50 U微球菌核酸酶（例如，N128635）。通常以粉末形式提供；将微球菌核酸酶溶解在dH2O中至所需浓度，并以小等分试样保存在-20°C下。等分试样可以重新冷冻并重复使用一次。这一步需要仔细控制，尤其是在最初的准备工作中。

高浓度的微球菌核酸酶可能会过度消化染色质，导致亚核小体颗粒。您的目标应该是获得长/中寡核小体阶梯。如果需要纯单核小体制剂来进行线性蔗糖梯度（5-20%），这将依赖更高的分辨率。

步骤

1. 在37°C下进行微球核酸酶消化5分钟。

2. 通过添加0.2 M EDTA至终浓度为5 mM来终止反应。

3. 将所有样品置于冰上5分钟；离心样品（12,000 g，5分钟）。

4. 转移并保留第一个上清液。

• 4°C 保存过夜。

提示：这里的上清液称为S1组分；总体积1.0 ml。

5. 将沉淀重悬于1.0 ml裂解缓冲液中，并用2 L相同缓冲液透析过夜。

6. 透析过夜后，离心样品。

• 我们建议在4°C下以1800 g离心10分钟。

7. 转移上清液并于4°C保存。

提示： 上清液可称为S2组分；透析后总体积约1.2ml。

8. 将不溶性沉淀物质重悬于200 μl裂解缓冲液中。

提示： 沉淀部分也可称为P组分。

第 3 阶段  可溶性染色质组分分析

步骤

1. 检查所有样品的 A260/A280。

1.1. S1、S2 和 P 组分的比率分别约为 1.7、1.5 和 1.3。

1.2. 通过 1.2% 琼脂糖凝胶电泳分析所有样品。

1.3. 准备样品：x µl（总共 5 µg）染色质组分（S1、S2 和 P）、y µl dH2O（x+y = 25 µl）、3 µl 1% [w/v] SDS（最终浓度 0.1 %), 2 μl 凝胶上样缓冲液，含有溴酚蓝。

警告： 由于存在 SDS，请勿将溴化乙锭放入琼脂糖凝胶或电泳缓冲液中。

2. 电泳结束后，用 0.5 μg/ml 溴化乙锭对凝胶进行染色。

第4阶段  免疫沉淀

步骤

1. 100-200 μg 未固定染色质 + 100-200 μl 亲和纯化抗体 (50-100 μg Ig)，并用孵育缓冲液将最终体积补至1.0 ml。

• 还需要设置未添加抗体的阴性对照来测试染色质与Protein A Sepharose 的任何非特异性结合。

2. 在缓慢旋转的转盘上4°C 孵育过夜。

• 添加 200 μl 50% v/v 蛋白A琼脂糖凝胶。
• 在快速旋转的转盘上室温孵育3小时。

警告： 确保琼脂糖凝胶始终处于悬浮状态。

注意：使用尖端被切断的硅化移液器添加蛋白A琼脂糖凝胶。

3. 离心样品，取出并保留上清液。

• 我们建议在4°C下以 2,000 g 离心10分钟。
• 这里的上清液是未结合的（或“U”）组分。

4. 将琼脂糖沉淀重悬于1 ml缓冲液A中。

• 用硅化巴斯德吸管，在15 ml硅化管补充9 ml缓冲液A。

5. 离心样品，弃去上清，并依次用10 ml缓冲液B和缓冲液C洗涤琼脂糖凝胶。

• 我们建议在4°C下以 2,000 g 离心10分钟。

6. 将琼脂糖凝胶重悬于1 ml 缓冲液C中，然后转移回硅化Eppendorfs 中。

7. 离心样品并重悬琼脂糖沉淀。

7.1. 我们建议在4°C下以 2,000 g 离心10分钟。

7.2. 重悬于250 μl 1.0% SDS/孵育缓冲液中，并在快速转盘上室温孵育15分钟。

警告：确保琼脂糖凝胶始终彻底重悬。

8. 离心样品，转移并保留上清液。

• 我们建议在4°C下以 2,000 g 离心10分钟。

提示： 这里的上清液称为结合（或“B”）部分。

9. 用 250 μl 1.0% SDS/孵育缓冲液清洗琼脂糖凝胶并立即离心。

9.1. 我们建议在4°C下以 2,000 g 离心10分钟。

9.2. 转移上清液并与上一步中的先前结合组分合并。

第5阶段  DNA 分离

向每个结合组分中添加 500 μl 孵育缓冲液，以将SDS浓度降低至0.5% SDS。然后可以如下处理未结合和结合的组分。

步骤

1. 添加 0.33 体积（330 μl）苯酚/氯仿；涡旋和旋转。

1.1. 我们建议在微量离心机中以 13,000 rpm 的转速旋转10分钟。

1.2. 保留有机相和界面；这用于分离免疫沉淀蛋白（见下文）。

2. 将水性上清液转移至等体积（1.0 ml）的苯酚/氯仿中；涡旋并旋转（13,000 g，10 分钟，微量离心机）。

• 我们建议在微量离心机中以 13,000 g 旋转 10 分钟。

3. 将上清液转移至等体积（1.0 ml）的氯仿中；涡旋和旋转。

• 我们建议在微量离心机中以 13,000 g 旋转10分钟。

4. 将上清液转移至干净的离心管中，并添加 0.1倍体积（100 μl）4 M LiCl、50 μg 糖原作为载体、以及4倍体积的乙醇。

4.1. 糖原应为分子生物学级，以 2 mg/ml 溶解在dH2O中。

4.2. 彻底涡旋并在-20°C下放置过夜。

5. 离心样品以沉淀 DNA。

• 我们建议以13,000 g 离心15分钟。

6. 用70%乙醇洗涤沉淀，并将 DNA 重新溶解在250 μl TE 缓冲液中。

注意： 乙醇应该是分子生物学级的。

7. 将样品储存在-20°C或继续进行检测方法。

• 检测方法可能会根据您的实验设计而有所不同，例如 PCR、微阵列。

提示： PCR 用于量化特定位点的DNA水平。使用可以使用该工具设计的引物对其进行半定量分析（通过琼脂糖凝胶分析 PCR 最终产物）。

第6阶段  蛋白质分离

步骤

1. 向第一苯酚/氯仿相（参见 DNA 分离，步骤 1）中添加 5 μl 1 mg/ml BSA 溶液（用作载体）、0.01体积（4 μl）10 MH2SO4和12体积丙酮。

2. -20°C过夜沉淀后，用酸化丙酮洗涤蛋白质沉淀一次，用干燥丙酮洗涤3次。

2.1. 酸化丙酮：1:6 100 mM H2SO4:丙酮。

2.2. 蛋白质可以通过 SDS-PAGE 进行分析。

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