转移并固定到膜上的 RNA 样品可以与特异的探针杂交，从而用来对所感兴趣的 RNA 进行定位。视实验人员和条件的差异，可以从多种方法中选择任意一种来标记和检测探针。用抑制非特异吸收探针的封闭试剂处理膜之后，在适于探针和固定的靶 RNA 杂交的条件下将膜同探针孵育，而后广泛洗膜以去除非特异结合的探针，最终在膜上产生 一个紧密结合探针的影像分布。分析了杂交结果之后，探针可以从膜上洗去，膜可重复使用于下一个实验。本实验来源「分子克隆实验指南第三版」黄培堂等译。

操作方法

Northern杂交

原理

转移并固定到膜上的 RNA 样品可以与特异的探针杂交，从而用来对所感兴趣的 RNA 进行定位。视实验人员和条件的差异，可以从多种方法中选择任意一种来标记和检测探针。用抑制非特异吸收探针的封闭试剂处理膜之后，在适于探针和固定的靶 RNA 杂交的条件下将膜同探针孵育，而后广泛洗膜以去除非特异结合的探针，最终在膜上产生 一个紧密结合探针的影像分布。分析了杂交结果之后，探针可以从膜上洗去，膜可重复使用于下一个实验。

材料与仪器

DNA 或 RNA 探针
预杂交液 SSC
滤纸 沸水浴 水浴

步骤

一、材料

1. 缓冲液和溶液

预杂交液（0.5 mol/L pH 7.2)，7% (m/V) SDS，1 mmol/L EDTA ( pH 7.0)）

SSC ( 0.5X，1X，和 2X ) 含 0.1% (m/V) SDS

SSC ( 0.1X 和 0.5X）含 0.1% (m/V) SDS

2. 核酸和寡核苷酸

DNA 或 RNA 探针（> 2X10⁸ cpm/μg）

固定于膜上的 RNA

3. 专用设备

滤纸（Whamian 3 MM 或相当效果的滤纸)

沸水浴

预热到 68℃ 的水浴

预设到杂交温度的水浴

二、方法

1. 在 10~20 ml 预杂交液中 68℃ 温育膜 2 h。

2. 若使用双链探针，在 100℃ 下加热 ³²P 标记的双链 DNA 5 min，使之变性，然后迅速移至冰水中冷却。

3. 把变性的或单链放射性标记的探针直接加到预杂交液中，在合适的温度下继续温育 12~16 h。

4. 杂交后，将膜从塑料袋中取出，在室温下迅速转移到含有 100~200 ml 1X SSC，0.1% SDS 的塑料盒内，将盒盖好，置于水平振荡器上，温和振荡 10 min。

5. 将膜转移至另一含有 100~200 ml 预热至 68℃、含 0.1% SDS 的 0.5X SSC 的塑料盒中。68℃ 下温和振荡 10 min。

6. 重复步骤 5，再洗涤至少 2 次，使 68℃ 下共洗涤 3 次。

7. 在印迹纸上晾干膜，然后让膜于 -70℃ 下在含增感屏的暗盒内对 X 线片（Kodak XAR-5 或相应的胶片）放射自显影 24~48 h。此外，也可通过磷图像系统扫描得到膜上的图像。

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