亚细胞组分如细胞核的蛋白质组的完整性很大程度上由纯化过程中是否将其他细胞污染物从分离到的组分中除去决定。从植物中分离高纯度的细胞核是一个困难的任务。本实验来源「植物蛋白质组学实验指南」〔法〕H.蒂勒门特、M.齐维、C.达默韦尔、V.米琴主编。

操作方法

核蛋白提取

材料与仪器

水稻悬浮细胞
匀浆液 裂解缓冲液 SDS 样品缓冲液 磷酸缓冲液

步骤

( 1 ) 按照 Morre 和 Anderson 的方法从水稻悬浮细胞中分离细胞核，本文对方法进行了一些改动。所有分离细胞核的步骤都在冰上或 4°C 进行。

( 2 ) 3000 g 离心 5 min 收集约 3 g 水稻悬浮细胞并重悬于 5 ml 冰浴预冷的 PBS 中。悬浮液再次用 3000 g 离 心 5 min。沉淀用 5 ml 匀浆液重悬后转移至玻璃研钵中并研磨成匀浆。

( 3 ) 匀浆用双层  Miracloth ( Calbiochem、Darmstadt、Germany) 过滤两次。

( 4 ) 转移匀浆至 15 ml  falcon 管中并用 1000 g 离心 10 min。

( 5 ) 轻轻地用匀浆液重悬沉淀并置于 2.0 mol/L 蔗糖梯度顶端，然后在 4°C 条件下 50000 g 离心 30 min。蔗糖梯度包含 37.5 mmol/L Tris-马来酸（pH 6.5 ) 、5 mmol/L MgCl₂ 和 1% 糊精 T500。

( 6 ) 小心地除去上清液，沉淀再次轻轻地用 5 ml 匀浆液重悬。

( 7 ) 再次将重悬液置于 2.0 mol/L 蔗糖梯度顶端并用 50000 g 离心 30 min。将含有细胞核的沉淀重悬于 100 μl 匀浆液中并用光学显微镜观察。（ 图 9-1A ) 。

( 8 ) 含有细胞核的悬浮液被用来提取核蛋白。可以用裂解缓冲液提取用于双向电泳的蛋白质样品，或用 SDS 样品缓冲液提取用于 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳的蛋白质样品。每 20 μl 悬浮液中的细胞核可用 500 μl 裂解缓冲液或 SDS 样品缓冲液在玻璃匀浆机中溶解。

( 9 ) 核蛋白的纯度通过使用抗组蛋白 H1 抗体的 Western 杂交分析来检测（SantaCruz  Biotechnology， Santa  Cruz,  CA) (图 9-1B) 。

( 10 ) 利用双向电泳分离用裂解缓冲液从纯化后的细胞核中提取的蛋白质 ( 500 μg ) 。（图 9 - 2 , 见注释 1)。

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