核糖核酸酶保护实验（Ribonuclease protection assay，RPA）是近十年发展起来的一种全新的mRNA定量分析方法。其基本原理是将标记的特异RNA探针（32P或生物素）与待测的RNA样品液相杂交，标记的特异RNA探针按碱基互补的原则与目的基因特异性结合，形成双链RNA；未结合的单链RNA经RNA酶A或RNA酶T1消化形成寡核糖核酸，而待测目的基因与特异RNA探针结合后形成双链RNA，免受RNA酶的消化，故该方法命名为RNA酶保护实验。对于32P标记的探针，杂交双链进行变性聚丙酰胺凝胶电泳，用放射自显影或磷屏成像系统检测被保护的探针的信号；对于生物素标记的探针，杂交双链经过变性聚丙酰胺凝胶电泳后电转移至尼龙膜，采用链霉亲和素－辣根过氧化物酶（Streptavidin-HRP）和化学发光底物与膜上biotin标记的探针结合，X射线胶片或化学发光图像分析仪检测杂交信号。

操作方法

核酸酶保护

材料与仪器

核酸酶
ATP CTP GTP MUTP EDTA NaCl 甲酰胺 Tris-HCl RNase A RNase T1 RNasin DTT UTP T7RNA聚合酶 DNaseⅠ 饱和酚 氯仿 酵母tRNA NaAc 无水乙醇 SDS 蛋白酶K 异丙醇 丙烯酰胺 亚甲双丙烯酰胺 TBE 尿素 过硫酸胺 TEMED
低温离心机 恒温培养箱 恒温水浴锅 电泳仪 保鲜膜

步骤

1.  在一个高压过的微量离心管中建立20 μl 的反应复合物如下：
（1）4 μl  5×转录缓冲液

（2）1 μl  200 mmol/的3NTP混合液

（3）10 μl  ［α-³²P］CTP

（4）1 μl  胎盘核酸酶抑制剂

（5）1 μl  1 mg/ml 模板DNA

（6）1 μl  噬菌体RNA聚合酶

（7）SP6 RNA聚合酶反应时在40℃保温30~60 min。采用T7或T3 RNA聚合酶则在37℃温育。   2.  加人5 μg 或10 U 无RNA酶的酶 I，37℃温育15 min。

3.  加入2 μl 10 mg/ml 的tRNA，补水至50 μl，以酚/氯仿/异戊酵抽提。

4.  水相加入200 μl，2.5 mol/l 乙酸铵和750 μl 无水乙醇，混匀后在冰浴饭置15 min，于4℃在微量离心机中离心15 min。   5.  重溶于50 μl 水，按第4步操作所述重新沉淀两次，最后得到的沉淀以75%乙醇/25% 0.1 mol/l pH5.2的乙酸钠缓冲液洗涤，晾干沉淀并溶解于100 μl 杂交液，取1 μl 计数。   6.  RNA以乙醇沉淀，并溶解于30 μl 含5×10⁵ cpm RNA探针的杂交液中，于85℃加热变性5 min，移至设定的杂交温度（30~60℃），温育8 h 以上。

7.  加入350 μl 含40 μg/ml 的核酸酶A和2 μg/ml 核酸酶T1的核酸酶消化缓冲液，于30℃温育30~60 min。

8.  加入10 μl 20%SDS和2.5 μl 20 μg/ml 的蛋白酶K，37℃温育30~60 min。

9.  用400 μl 酚/氯仿/异戊醇抽提，水相移入含1 μl 10 mg/ml tRNA的离心管中，加入1 ml 乙醇沉淀，晾干后溶解于3~5 μl RNA加样缓冲液中。

10.  于85℃加热变性3 min，在变性的聚丙烯酰胺/尿素凝胶（序列胶）中电泳，用增感屏放射自显影过夜，分析结果。

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