用培养液制备细胞悬液，将悬液注入单元的各小室内。使长边朝下，放置。将单元旋转 90度，放平后用 CO2 充气。然后封闭，进行培养。

操作方法

Nunc细胞工厂

原理

用培养液制备细胞悬液，将悬液注入单元的各小室内。使长边朝下，放置。将单元旋转 90度，放平后用 CO2充气。然后封闭，进行培养。

材料与仪器

单层细胞 0.25%天然胰蛋白酶 D-PBSA
生长培养液
Nunc细胞工厂 硅酮管和连接器 血细胞计数板或电子细胞计数器和计数用液体

步骤

1. 用胰蛋白酶消化后，将细胞悬浮，计数细胞，用 2 L 培养液将悬液稀释至细胞密度为 2x10⁴ 个/ml。

2. 使小室长边朝下，放置，将培养液供应管与 Luer 连接管相接，再通过供应管与底孔连通。



3. 经供应管加入细胞和培养液。所有培养小室内的液体将达到相同水平。

4. 按单层细胞平面将小室转动 90度，使单元的短边朝下，放置，使进孔和供应管朝上。

5. 在 Luer 连接管处，中断供应管与培养液储存器的连接。

6. 与细胞单层平面垂直，将培养小室转动 90度，以底部放平，使培养面呈水平位。

7. 用 5% CO₂ 空气向单元充气 5 min，然后夹住供应管和出口。如果需要，可连续充气。

8. 倒掉供应管和出口内的培养液，然后将单元移入培养箱。

9. 更换培养液（或收集培养液）时，按步骤 6 的相反程序操作。除去输入管上的滤器，然后按步骤 4 相反程序操作。

10. 擦洗 Luer 连接管，松开夹具，使培养液流出。

11. 按步骤 2~8 更换培养液。

12. 收集细胞。

(a)按步骤 9 和步骤 10 除去培养液。

(b)加入 500 ml D-PBSA，然后除去。

(c)加入 4℃的 500 ml 胰蛋白酶，30 s 后除去。

(d)用剩余的胰蛋白酶将细胞消化 15 min。

(e)加入培养液，摇动培养小室，使细胞悬浮。

(f)按步骤 9 和步骤 10 取出含细胞的培养液。

13. 残留细胞可用于接种下一批细胞，虽然这种方法难以控制接种密度。最好是将培养小室丢弃，用新的小室重新开始培养。

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