方法

准备待电穿孔的细胞

1 . 在电穿孔前 24〜72 h ，将细胞分离并在合适的含血清的完全培养基中培养。
这步操作要保证细胞健康并有高增殖能力，这将增强细胞对电穿孔的耐受力并提高电转染的效率。

2•当培养的细胞达到对数生长中期或者末期时（或 者 60%〜90% 覆盖率），收集细胞。

对于黏附细胞，用 IX 胰蛋白酶-EDTA 溶液（预热到 37C ) 消化，然后室温下用 P B S 或者其他清洗缓冲液洗一次。

3.20°C ， 250 g 离 心 5m i n 收集细胞。用电穿孔缓冲液重悬细胞至细胞密度为每 i 〇〇ul 5X 10⁵〜5X 10⁶ 个细胞。

4 . 将 2〜IOug DNA 和 IOOmI 细胞悬液混合，转移到电穿孔管中。

虽然有些时候推荐在电穿孔前解育细胞和 D NA 的混合物，但并没有必要。这步操作应该在室温下进行。

电穿孔

5•轻敲装有 DNA 和细胞的电穿孔管（细胞在管中放置了一段时间后会沉淀），然后置人电穿孔槽中。

6 . 选择合适的电穿孔仪参数并开始电穿孔。

7•电穿孔后立刻向管中加入 500〜900ul完全培养基，并将电穿孔过的细胞转移到合适的培养器皿中（如 6 孔板）。加入培养基维持细胞继续生长。
对于稳定转染，只需从管中转移一部分电转染的细胞（1/10〜1/20 体积）到培养器皿中。

8 . 在合适的生长条件下培养细胞过夜。如果发现明显的细胞死亡，更换完全培养基。

基因表达分析

9 . 如果实验的目的是稳定转染，直接跳到步骤 1 〇。对于瞬时表达，在转染 24〜72 h 后收集细胞，选用恰当的方式检测基因表达，如使用流式细胞术、 RNA 杂交、免疫或酶检测。如果转染的基因带有一段荧光标签，可以用荧光显微镜观察。

1 0 . 获得稳定转染的细胞：在完全培养基中生长 48〜72 h 后 ，将细胞转移到合适的培养基。在合适的条件下继续培养细胞。

操作和参数举例

1•细胞和密度： IOOul 细胞培养基中含 IO6 个 S V E C (A T C C ) 细胞。

2•转运材料： 2f x g p E G F P - N l 质粒 D N A (Clontech)。
3 . 电穿孔缓冲液： D M E M 细胞培养基。

4•准备：

a•用胰蛋白酶-E D T A 消化细胞并用无血清的 D M E M 培养基清洗细胞一次。

b. 室温， 250 g 离 心 5 min 收集细胞。

c. 用 IOOmI D M E M 培养基重悬细胞并与 V g 质粒 D N A 混合。

d. 将混合物转移到一个内径为 4m m 的电穿孔管中。

e•将管置人 BTX ECM830 型电穿孔仪的电穿孔槽中，施 加 150V/c m 的短暂电压50ms

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