本方案用磷酸酶去除核酸的 5' 磷酸根，然后在 T4 噬菌体多核苷酸激酶的催化下，以放射性标记的形式重新将磷酸加到核酸上，这是一种广泛应用于 32P 标记探针的技术。本实验来源「分子克隆实验指南第三版」黄培堂等译。

操作方法

含5’突出羟基端的DNA分子磷酸化

原理

本方案用磷酸酶去除核酸的 5' 磷酸根，然后在 T4 噬菌体多核苷酸激酶的催化下，以放射性标记的形式重新将磷酸加到核酸上，这是一种广泛应用于32P 标记探针的技术。

材料与仪器

T4 噬菌体多核苷酸激酶 DNA
乙酸铵 EDTA 乙醇 T4 噬菌体多核苷酸激酶缓冲液
液体闪烁计数仪 Sephadex G-50 离心柱 Sephadex G-50 柱

步骤

一、材料

1. 缓冲液和溶液

乙酸铵（10 mol/L)

EDTA ( 0.5 mol/L，pH 8.0 )

乙醇

2. 酶和缓冲液

T4 噬菌体多核苷酸激酶

10X T4 噬菌体多核苷酸激酶缓冲液

3. 核酸和寡核苷酸

DNA (10~50 pmol)

4. 放射性复合物

[γ-³²P] ATP ( 10 mCi/ml，比活性为 3000~7000 Ci/mmol）

5. 专用设备

液体闪烁计数仪，可通过契仑科夫辐射测量 ³²P

Sephadex G-50 离心柱，用 TE ( pH 7.6) 平衡

或

Sephadex G-50 柱（1 ml)，用 TE ( pH 7.6) 平衡

二、方法

1. 在一个微量离心管中混合下列试剂：

去磷酸化的 DNA                             10~50 pmol

10X T4 噬菌体多核苷酸激酶缓冲液   5 μl

10 mCi/ml [γ-³²P] ATP

( 比活性为 3000~7000 Ci/mmol)       50 pmol

T4 噬菌体多核苷酸激酶                   10 单位

水                                                  加至 50 μl

37℃ 温育反应 1 h。

2. 加入 2 μl 0.5 mol/L EDTA ( pH 8.0) 以终止反应。用液体闪烁计数仪中的契仑科夫计数测量反应混合物中的总放射性。

3. 通过以下任一方法分离放射性标记探针与未掺入的 dNTP：

用 Sephadex G-50 离心柱层析

或

用 1 ml Sephadex G-50 柱（用 TE 平衡）常规尺寸排阻层析

或

用乙酸铵和乙醇对放射性标记的 DNA 进行两轮选择性沉淀

4. 通过契仑科夫计数测定探针制品中的放射性量，用探针中放射性含量除以反应混合物中的放射性总量来计算放射性标记物转移到 5' 端的效率。

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