什么是Polybrene？其作用机制是什么？

Polybrene（化学名：溴化六二甲铵）是一种季铵类聚合物，在生理pH条件下携带强正电荷。细胞表面蛋白聚糖带负电荷，逆转录病毒和慢病毒的包膜同样带负电荷，两者之间存在静电排斥，降低了病毒颗粒与靶细胞发生有效接触的概率。

向转导培养基中加入Polybrene后，该多阳离子聚合物在病毒颗粒与细胞表面之间架桥，中和排斥电荷，促进病毒稳定吸附于细胞膜，从而显著提高病毒进入细胞的效率，进而改善转基因的整合与表达。

Aladdin Scientific的Polybrene（10 mg/mL）（货号：P1501912）以无菌过滤的水溶液形式提供，无需实验室自行配制，降低污染风险及浓度不一致的问题。

病毒转导推荐操作方案

所需材料：Polybrene（10 mg/mL）原液（货号：P1501912）、病毒上清液、靶细胞、完全生长培养基、离心机（可选，用于离心转导）。

1. 解冻与稀释：在冰上或4°C条件下解冻Polybrene原液，用无血清或完全培养基稀释，使终浓度达到4–8 µg/mL。最佳浓度应针对每种细胞类型进行实验优化，因不同细胞对Polybrene毒性的敏感性不同。
2. 铺种靶细胞：在转导前一天以30–50%汇合度铺种细胞，确保细胞处于活跃增殖状态，有助于提高逆转录病毒的整合效率。
3. 配制转导混合液：将病毒上清液与含Polybrene的培养基按适当比例混合，以达到所需的感染复数（MOI）及工作范围内的Polybrene终浓度。
4. 孵育：将转导混合液加入细胞，在37°C、5% CO₂条件下孵育4–24小时，具体时间视细胞类型和病毒载体而定。
5. 更换培养基：孵育结束后，吸去转导培养基并更换新鲜完全生长培养基，以减少Polybrene的细胞毒性。
6. 评估转导效率：转导后48–72小时，通过荧光显微镜、流式细胞术或qPCR等适当方法评估报告基因或转基因的表达情况。

注意：对于敏感细胞类型（如原代神经元、造血干细胞），建议从较低的Polybrene浓度（2–4 µg/mL）开始，逐步优化。

储存、操作与安全注意事项

储存：Polybrene（10 mg/mL）应在-20°C条件下避光保存。避免反复冻融，以免影响试剂性能。建议收到产品后立即分装为单次用量，以维持溶液的稳定性。

操作：操作全程应在无菌条件下进行，使用无菌移液吸头和离心管处理原液。使用前将分装液在室温或4°C下平衡，切勿加热以加速解冻。

细胞毒性：Polybrene具有浓度依赖性细胞毒性。对于敏感细胞系，过高浓度（通常超过10 µg/mL）会损害细胞活力。在对新细胞类型进行转导优化时，应同步开展细胞毒性滴定实验。

生物安全：在慢病毒或逆转录病毒转导实验中使用Polybrene时，所有操作必须符合机构针对相应病毒生物安全等级（大多数复制缺陷型慢病毒载体为BSL-2级）的生物安全规定。请咨询所在机构的生物安全委员会（IBC）以获取经批准的操作规程。

故障排查：常见问题与解决方案

• 添加Polybrene后转导效率仍低：确认病毒滴度是否足够。确认Polybrene浓度在工作范围内。考虑采用离心转导法（在32°C、800–1200 × g条件下离心30–90分钟）以进一步增加病毒与细胞的接触。确保转导时细胞处于活跃分裂状态。
• 转导后细胞死亡率高：逐步降低Polybrene浓度。缩短转导孵育时间，提前更换培养基。利用细胞毒性检测方法确定目标细胞系所能耐受的最大Polybrene浓度。
• 实验间结果不一致：确保Polybrene分装液在-20°C避光保存，避免多次冻融。规范化病毒上清液的制备和滴度测定方法。
• Polybrene沉淀：在浓度过高或与不相容缓冲液接触时可能发生沉淀。始终在使用前即时用细胞培养级培养基配制工作稀释液。