本实验来源「分子克隆实验指南第三版」黄培堂等译。

操作方法

聚合酶链式反应

材料与仪器

热稳定 DNA 聚合酶 旁观者 DNA 正向引物 反向引物 模板 DNA
扩增缓冲液 氯仿 dNTP 贮存液
聚丙烯酰胺凝胶或琼脂糖凝胶 屏蔽型枪头 离心管 正向排液式移液器 PCR仪

步骤

一、材料

1. 缓冲液与溶液

10X 扩增缓冲液

氯仿

4 种 dNTP 贮存液（20 mmol/L，pH 8.0)

2. 酶与缓冲液

热稳定 DNA 聚合酶

3. 凝胶

聚丙烯酰胺凝胶或琼脂糖凝胶

4. 核苷酸与寡聚核苷酸

旁观者 DNA

正向引物（20 μmol/L）及反向引物（20 μmol/L) 溶于水中

模板 DNA

5. 特殊设备

自动微量移液器的屏蔽型枪头

离心管（0.5 ml，薄壁扩增反应专用离心管）

正向排液式移液器

6. PCR 仪

二、方法

1. 按以下次序，将各成分加在 0.5 ml 灭菌离心管、扩增管或灭菌滴定板的孔内混合：

10X 扩增缓冲液                                      5 μl

20 mmol/L 4 种 dNTP 混合液（pH 8.0）  1 μl

20 μmol/L 正向引物                                2.5 μl

20 μmol/L 反向引物                                2.5 μl

1~5 U/μl 热稳定 DNA 聚合酶                  1~2 单位

H₂O                                                     28~33 μl

模板 DNA                                              5~10 μl

总体积                                                  50 μl

2. 如果 PCR 仪没有配置加热盖，在反应混合液的上层应加一滴轻矿物油（约 50 μl)， 防止样品在 PCR 反应多个循环过程中蒸发。如果应用热启动方案程序，在反应混合液的上层可加一层石蜡油。放置微量离心管或微量滴定板在 PCR 仪上。

3. 按以下方法进行 PCR 扩增。典型的程序有变性、复性和聚合（延伸反应）；相应的循环条件与温度列表如下：

这些循环数设置适合 50 μl 反应体系在 0.5 ml 薄壁离心管内进行，反应管温育在 PCR 仪上进行靶基因扩增，所用 PCR 仪可以是 Perkin-Elmer9600 或 9700；也可以是 Eppendorf 公司的 Master cycler PCR 仪；也可以是 MJ Research 公司的 PTC100。这里的循环数与温度设置条件也可能适合在其他类型的设备及不同的反应体积。

聚合反应应该根据靶基因的长度按每分钟聚合 1000 bp 的速率来计算所要设置进行聚合反应的时间。大多数 PCR 仪设置的最后一个程序是扩增样品温育在 4℃ 上，直到扩增样品从 PCR 仪上取走。有些扩增样品可以在 PCR 仪上过夜，以后贮存在 -20℃ 中。

4. 抽取每种扩增样品 5~10 μl 用琼脂凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳来分析扩增结果，用 DNA marker 来判断扩增片段的大小。凝胶一般用 EB ( 溴化乙锭）或 SYBR 金颗粒染色后来观察扩增的量与片段大小。

一次成功的扩增反应应该产生与我们预期大小一致的 DNA 片段。扩增条带可用 DNA 序列分析，Southern 杂交和限制性内切核酸酿酶切图谱予以鉴定。

如果以上这些鉴定都表明扩增产物是正确的，则从凝胶电泳的不同泳道可做进 一步分析；从两管阳性对照样品的相应分子量的目的条带的亮度与粗细可判断 PCR 扩增的效率；阴性对照样品在目的条带附近应该没有相应条带的。

5. 若用矿物油覆在微量离心管内样品液体的上层，反应结束后可用 150 μl 氯仿抽提去除。

在 PCR 反应管内，包含扩增 DNA 片段的水相与上层矿物油的界面形成弯月面，在弯月面下面的水相还有微胶粒。可用自动移液器小心吸取水相液体转移到一个新的离心管内。为了许多目的（如用 Cemricon 微量浓缩器纯化扩增 DNA 样品或者进一步克隆这种扩增产物）都必须把这种矿物油从样品中去除。

PCR 的优化

在 PCR 的优化开始阶段，应用新的 DNA 模板，引物或热稳定 DNA 聚合酶等材料建立的 PCR 方法，其扩增效果一般总不是最佳的。这种 PCR 反应通常要求尽量抑制非特异性扩增和（或）增加目的 DNA 产物的产率。

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