本实验主要用于培养猪甲状腺细胞。

操作方法

细胞培养技术

原理

由于甲状腺富含纤维性组织，所以甲状腺的消化分离一般采用胶原酶与胰蛋白酶联合消化法，用单一的胰蛋白酶消化效果一般；促甲状腺激素(TSH)是培养甲状腺细胞必备的，它能够起到促进甲状腺细胞生长的作用。

材料与仪器

猪甲状腺
F-12培养基 胎牛血清 胰蛋白酶 胶原酶Ⅳ 牛 TSH
眼科剪 滴管 离心机 培养皿 CO2培养箱

步骤

一、实验步骤

1. 杀猪后迅速取出甲状腺 1～2 个，置于盛有 75%酒精的烧杯中，用冰盒送至实验室(1 h 以内)。   2. 立即置于pH为7.4 的PBS缓冲液(含青链霉素)中，反复漂洗，直至漂洗液清澈透明。   3. 去除包膜及结缔组织，用眼科剪子、镊子将甲状腺组织剪成1mm³ 大小的碎块。   4. 置含0.25%胰酶和300 U/ml 胶原酶的容器中，放于 37℃温箱中消化60 min，每隔15min 需摇动一次。   5. 用吸管将上清液的三分之二吸入离心管中，并加入含有胎牛血清的培养基终止消化。   6. 以1000  rpm 离心10分钟后，弃上清。   7. 将细胞沉淀用F-12 培养基制成细胞悬液，充分吹打并用不锈钢网(200目)过滤，再以1000 rpm 离心10分钟，弃上清。   8. 沉淀悬于含15% 胎牛血清和1 U/L牛 TSH的F-12 培养基中，台盼蓝染色证明活细胞数大于95%，调整细胞浓度接种于培养板中(1 ml/孔)。   9. 置于 37℃的5% CO₂ 孵箱中，每 2-3 天换液一次，至细胞融合成片后用于实验。
二、结果

猪甲状腺细胞培养 24 小时，镜下细胞贴壁，呈聚集生长，细胞呈圆形或椭圆形，如下图。

    图 1  培养 24 小时后的猪甲状腺细胞

注意事项

1. 原代培养时，接种的细胞活性的好坏直接关系到培养的成败。

2. 组织热缺血时间短的组织的细胞活性好。取材后尽量不要耽搁时间，宜尽快处理并培养。

3. 对于仅为单纯独立的甲状腺腺瘤而质地较软的组织，因相对容易消化，消化时间可以适当缩短。

4. 镜下观察接种到培养瓶中的原代细胞，若大部分为5～10个相连的细胞小团，就最容易生长。

常见问题

胰蛋白酶适于消化细胞间质较少的软组织如上皮组织、肝、肾等，对传代细胞也非常好。

但消化纤维性组织或较硬的癌组织则效果较差。胶原酶对胶原有很强的消化作用，适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织等。

由于甲状腺富含纤维性组织，所以甲状腺的消化分离一般采用胶原酶与胰蛋白酶联合消化法，用单一的胰蛋白酶消化效果一般；促甲状腺激素(TSH)是培养甲状腺细胞必备的，它能够起到促进甲状腺细胞生长的作用。

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