小鼠腹腔巨噬细胞原代培养可应用于：

（1）细胞保种；（2）分子生物学研究；

（3）基因治疗研究。

操作方法

腹腔取材法

原理

巨噬细胞属免疫细胞，有多种功能，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活2－3周，多用做原代培养，难以长期生存。

材料与仪器

小鼠
RPMI1640培养基 酚红 酒精 小牛血清 巯基乙醇酸钠 双抗 培养液 小牛血清 青霉素 链霉素 台盼兰 碘酒
绵球 手术直剪 注射器 培养皿 超净台 解剖板 眼科剪 离心管 眼科镊

步骤

一、实验材料准备

1.   动物：各个品系的小鼠2-4只。

2.  试剂：RPMI1640培养基(含酚红)，小牛血清，双抗，培养液(10%小牛血清、RPMI1640、双抗)，台盼兰等。碘酒绵球和酒精绵球。

3.  器械：一次性注射器、手术器械。

 二、实验方法

如果采用刺激物，则可在实验前三天腹腔注射3%巯基乙醇酸钠每只2 mL，获得的巨噬细胞数要多一些。不采用刺激物，直接开始下面的步骤。

1.  拉颈处死小鼠，在75%酒精浸泡1-2分钟，移入超净台中，仰卧位固定于解剖板上，碘酒消毒腹部皮肤，酒精绵球脱碘。用手术直剪充分剪开腹部皮肤，暴露腹部肌层，再用酒精绵球消毒腹部肌层。

2.   用注射器抽取5 mL含双抗的RPMI1640培养基注入腹腔，用绵球轻揉腹部1-2 min，然后，用眼科镊稍提起腹腔，并用眼科剪剪开一个小口，用吸管吸取细胞悬液，移入离心管中(个人认为，此法比用注射器抽吸好一些)。

3.  1 000 rpm离心5 min后，用含双抗的RPMI1640培养基洗涤一次，再次离心，重悬细胞于含10%小牛血清的RPMI1640培养液中，如果是作为饲养细胞使用，则选择相应的培养液。台盼蓝拒染法计数，将细胞稀释到目的浓度后，接种即可。

4.  如果是作为饲养细胞使用，调整浓度至2x10⁵个/mL，接种到96孔板中，每孔100-200 uL；如果作为其它实验使用，可以调整成2x10⁶/mL，加到24孔平底培养板中，1 mL/孔；5% CO₂温箱孵育2 h后，换液，并用RPMI1640培养基洗1-2次，弃去未粘附细胞，贴壁细胞为单层的巨噬细胞。

 三、 结果

巨噬细胞刚贴壁时偏圆形，或者类似鹅卵石形状，然后慢慢伸出伪足，铺开呈三角形或多角形。巨噬细胞有吞噬的特性，当与细菌混合在一起的时候，在40倍物镜下可以看到巨噬细胞吞噬细菌，因此，巨噬细胞作为饲养细胞可以清除部分污染的细菌、支原体和部分细胞碎片。

注意事项

1.  巨噬细胞是终末分化细胞，不会增殖。

2.  很难消化下来，所以接种的时候，必须直接接种到目的培养器皿中。

3.  严格无菌操作，在超净台内进行。

4.  为避免交叉感染，每一只小鼠更换注射器。

5.  吸管吸取细胞悬液的时候，尽量不要吸到大小肠，否则容易引起成纤维细胞污染。

常见问题

巨噬细胞刚贴壁时偏圆形，或者类似鹅卵石形状，然后慢慢伸出伪足，铺开呈三角形或多角形。巨噬细胞有吞噬的特性，当与细菌混合在一起的时候，在40倍物镜下可以看到巨噬细胞吞噬细菌，因此，巨噬细胞作为饲养细胞可以清除部分污染的细菌、支原体和部分细胞碎片。

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