来源：《神经生物学实用实验技术》第四军医大学出版社

操作方法

基本方案

原理

施万细胞是周围神经系统的成髓鞘胶质细胞，能有效地促进外周神经的再生。近年的研究表明，施万细胞也能改善中枢神经再生的微环境，因此体外培养施万细胞势在必行。目前最简便、快捷分离纯化施万细胞的方法是差速贴壁法，即根据不同细胞在培养器皿上贴壁速度的差异，去除成纤维等污染细胞，以获得高纯度施万细胞。

材料与仪器

新生1-3d的大、小鼠仔鼠 2月龄成年大、小鼠
含10%胎牛血清DMEM培养基 0.05% Collagenase-Dispase 10µg ml层黏连蛋白(Laminin)
培养瓶

步骤

1.新生鼠施万细胞的获得

依照总论的方法消毒动物后详细步骤如下。无菌条件下分离出背根神经节，用含10%胎牛血清DMEM培养液吹打分散成细胞悬液（详见背根神经节细胞培养章节）。或分离提取动物双侧坐骨神经，PBS冲洗3次，置D-Hanks中，剥除结缔组织和神经外膜。取得的组织剪成约1mm³大小，入0.25%胰蛋白酶及0.06%胶原酶(Collagenase)复合消化液37℃分离消化40min。加入10滴胎牛血清终止消化后，900r/min离心5min,去除上清。然后依照总论的方法在含10%胎牛血清的DMEM培养液中制成单细胞悬液，调整合适的细胞浓度接种细胞于多聚赖氨酸包被的介质上，37℃,5%CO2的孵育箱内培养3-5d。:

2.成年大、小鼠施万细胞的获得

取雄性2月龄鼠1只，1%戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔麻醉，无菌条件下切断双侧坐骨神经远端。7d后，分离提取20-25mm经预变性处理的坐骨神经，PBS冲洗3次，置D-Hanks中，剥除神经外膜。取得的组织剪成约1mm³大小，0.05% Collagenase-Dispase复合消化液37℃分离消化3-5h,2000r/min,离心10min,弃上清。再用含10%FCS的DMEM培养基重悬，900r/min离心5min,弃上清。最后用含10%FCS的DMEM培养基将其制成单细胞悬液，接种于经10µg/ml Laminin覆层(37°C,2h)的培养皿中。37°C,5%C02培养3-5d。

3.施万细胞的培养

将上述两步培养的细胞经0.125%胰蛋白酶消化后，制成单细胞悬液，置于未覆层的培养皿中，37℃,5%CO₂孵箱中培养30min后，将未贴壁的细胞悬液转种于另－未包被的器皿中，30min后重复以上操作，最后将未贴壁细胞按照合适的密度接种在多聚赖氨酸或Laminin包被的培养器皿中。37℃,5%CO₂继续培养5-10d。培养至7d,典型的施万细胞形态呈小卵圆形或纺锤形胞体，立体感强，伸出双极、三极长而纤细的突起彼此交织成网络。随着培养时间的延长，较长的突起平行排列成束状，胞体“肩并肩” 生长，一致性很好。

注意事项

1.不同年龄阶段动物的施万细胞培养方法迥然不同，务必根据需要选择。

2.成功分离去除神经膜成分中的成纤维细胞是培养和纯化的关键。由于胎鼠的坐骨神经非常细小，只有尽量剥除神经外膜，才能有效地避免原代培养中成纤维细胞的过度增长。

3.成年鼠的施万细胞体外培养较为困难，其生长对Laminin基质有绝对依赖性，而新生鼠则在多聚赖氨酸覆层上就能很好地生长。

常见问题

1.传统经典的差速贴壁法是一种简便、经济、快速有效分离和纯化成年大鼠施万细胞的方法。笔者尝试的化学药物抑制、免疫亲和吸附法等其他方法存在药物抑制施万细胞活性、低产率、需要特殊仪器和耗时长等缺陷。

2.成年大鼠预变性时间最好为7-10d,否则影响细胞的产率和纯度。

3.多次实验证实预变性周围神经中施万细胞的增殖和活力均强于未激活神经

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